内质网应激对晶状体上皮细胞凋亡及白内障发病影响的初步研究

发布时间：2017-09-14 15:05

  本文关键词：内质网应激对晶状体上皮细胞凋亡及白内障发病影响的初步研究

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【摘要】：背景白内障是引起全球范围内视觉损伤的最主要因素,同时也是我国导致视力下降的主要原因。随着我国人口平均寿命的延长及人口老龄化趋势的加剧,白内障的发生不仅使患者的生活质量下降,而且也为医疗保险系统及社会增添了巨大的压力。而现阶段,手术治疗是治愈白内障的唯一方式。我们迫切需要从白内障的发病机制入手来寻找更广泛的防治手段。内质网应激((Endoplasmic reticulum stress,ERS)已成为近几年研究的热点。有文献报导在白内障的形成中,ERS发挥着作用。然而仍缺少系统完善的体内体外实验论证。本文将从两个角度分析在人晶状体上皮细胞凋亡过程中,内质网应激发生发展对其的影响。拟更深入的研究内质网应激的机制问题,为后续实验的进行提供可靠依据。目的1.研究ERS是否参与年龄相关性白内障和糖尿病性白内障的发生。2.探讨在氧化应激条件下,ERS的激活对人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells,HLECs)是细胞保护作用还是促凋亡作用。3.探讨在ERS发生的条件下Salubrinal对HLECs的保护作用及其机制。方法1.采用HE染色和免疫组织化学的方法检测年龄相关性白内障晶状体前囊膜30例、糖尿病性白内障晶状体前囊膜30例、正常晶状体30例中GRP78、CHOP、Caspase-12的阳性表达。2.体外培养人晶状体上皮细胞株HLE-B3于含10%胎牛血清的DMEM低糖培养基中,以H_2O_2建立氧化应激模型诱导ERS的发生。分别在H_2O_2干预和不干预的情况下,加入不同浓度的Salubrinal(10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L、35μmol/L),应用CCK-8试剂盒筛选适宜的Salubrinal浓度。3.实验分组为A组(正常对照组)、B组(H_2O_2200μmol/L组)、C组(H_2O_2200μmol/L+Salubrinal25μmol/L组),采用原位缺口末端转移酶标记法和流式细胞仪检测药物作用48h后HLE-B3的凋亡情况。4.不同时间点下提取B组蛋白,Western blotting检测不同时间点下GRP78、CHOP、Caspase-12、p-e IF2α的变化。5.特定时间点下提取A、B、C组三组蛋白,Western blotting检测各组GRP78、CHOP、Caspase-12、p-e IF2α的变化。结果1.HE及免疫组化结果显示:所有组织染色充分、固定良好、组织结构完整。3种蛋白在NC组中表现为阴性或弱阳性,而在ARC组与DC组中表达均为阳性,ARC组阳性率分别为78%、82%、79%,DC组阳性率分别为83%、75%、81%。2.CCK-8试剂盒结果显示,没有H_2O_2干预时,不同浓度的Salubrinal对HLE-B3的细胞活性无明显抑制作用,存活率分别为98.56±3.29%,98.73±2.58%,99.39±3.23%,98.57±1.89%,98.81±2.46%,99.34±3.23%,99.50±2.36%,差异无统计学意义(F=0.087,P=0.997);应用H_2O_2干预时,随着Salubrinal浓度的升高,HLE-B3存活分别为52.86±4.67%,65.01±3.56%,72.89±3.82%,84.45±3.57%,91.64±2.14%,93.12±2.92%,92.02±3.33%,与对照组相比,差异有统计学意义(P值均为0.000),当Salubrinal浓度大于25μmol/L时,HLE-B3细胞的存活率增加不明显(#P=0.555、0.878)。3.流式细胞仪检测3组的细胞凋亡率分别为1.93%±0.70%、8.80%±0.51%、4.29%±0.30%,各组之间差异有统计学意义(F=396.263,P=0.000,与A组比较P值均为0.000)。TUNEL染色结果分别为A组7.67%±0.99%,B组36.90%±0.95%,C组为16.69%±2.16%,凋亡指数差异有统计学意义(F=618.393,P=0.000,与A组比较P值均为0.000)。4.Western blotting结果表明:B组中随着H_2O_2作用时间的延长,p-e IF2α在6h表达量最高,GRP78在12h表达达峰,CHOP在12h开始升高,持续至24h,后又逐渐降低,在48h出现最高表达量,Caspase-12在48h表达明显增加。特定时间点下C组与B组相比,GRP78、CHOP、p-el F2α表达量增加,而Caspase-12表达降低。结论1.ERS参与年龄相关性白内障及糖尿病性白内障的发生;2.氧化应激发生的早期,ERS激活UPR反应从而发挥着细胞保护的作用,随着氧化应激条件的持续,ERS的相关凋亡通路激活;3.Salubrinal可以通过抑制ERS相关的凋亡通路,对H_2O_2诱导的HLE-B3凋亡起保护作用。
【关键词】：晶体 上皮细胞 内质网应激 细胞凋亡 桂皮酸盐类
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 英语缩略词表12-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-24
• 2 结果24-29
• 3 讨论29-34
• 4 结论34-35
• 参考文献35-40
• 综述 内质网应激与相关眼科疾病40-58
• 参考文献51-58
• 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果58-59
• 致谢59

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