Slingshot介导的Cofilin活化在缺氧肠上皮细胞屏障功能损害中的作用与机制研究

发布时间：2017-11-02 06:00

  本文关键词：Slingshot介导的Cofilin活化在缺氧肠上皮细胞屏障功能损害中的作用与机制研究

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【摘要】：长期以来,肠道被认为是严重烧创伤等外科应激的中心器官。烧伤后由于屏障功能损害所引起的机体病理生理紊乱已得到广泛认可,但其具体机制尚未完全清楚。本课题组既往研究表明,严重烧伤或缺血缺氧时肠上皮屏障功能损害与细胞紧密连接(Tight junction,TJ)相关蛋白以及F-肌动蛋白(F-actin)等有关,但分子机制仍不清楚。丝切蛋白(Cofilin)是一种重要的肌动蛋白(Actin)结合蛋白,在细胞骨架肌动蛋白的聚合与解聚动态平衡的调控中具有至关重要的作用,而Cofilin活性又直接受到其上游信号分子Slingshot(SSH)的调控。研究表明,SSH家族蛋白引起Cofilin去磷酸化而激活Cofilin,从而调控细胞骨架肌动蛋白聚合与解聚的动态平衡。严重烧伤早期损害的实质其实就是缺血缺氧性损害。因此,我们假设严重烧伤早期的缺血缺氧通过诱导SSH表达而引起肠上皮细胞Cofilin活化,导致细胞骨架肌动蛋白的聚合与解聚平衡失调,进一步引起紧密连接蛋白的变化,从而导致肠上皮屏障功能损害。据此,本课题拟通过体外实验建立单层肠上皮细胞模型,研究缺氧条件下肠上皮细胞SSH/Cofilin/F-actin通路的变化及其在严重烧伤早期肠上皮屏障功能损害中的作用,进而阐明其分子机制。一、方法1.常规培养人肠上皮细胞株Caco-2,将Caco-2细胞种植于Transwell聚碳酸酯膜,建立单层肠上皮细胞模型。将单层Caco-2细胞在1%O2环境条件下进行缺氧处理,缺氧时间分别为0、1、2、6、12及24h;另将单层Caco-2细胞分别用Jasplakinolide与Lat A进行处理,处理时间分别为0、1、2、6、12及24h。2.采用生物电阻测定仪检测跨上皮细胞电阻(TER),以反映单层肠上皮细胞屏障功能的完整性;用FITC-dextran示踪法检测单层肠上皮细胞通透性的变化。3.采用荧光法检测单层肠上皮细胞F-actin的分布以及F-actin/G-actin含量比值的变化。4.用间接免疫荧光法检测单层肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1及Occludin分布的变化,并用Western blot法检测单层肠上皮细胞ZO-1、Occludin及Claudin-1蛋白表达的变化。5.采用Western blot法分别检测单层肠上皮细胞Cofilin、p-cofilin、SSH-1、SSH-2及SSH-3蛋白表达的变化。二、结果1.缺氧引起单层肠上皮细胞TER明显下降。2.缺氧后单层肠上皮细胞纤维状肌动蛋白形态分布明显改变,F-actin/G-actin含量比值明显降低。3.缺氧单层肠上皮细胞Cofilin蛋白表达在各时相点均无明显变化,而磷酸化cofilin蛋白表达显著降低。4.缺氧引起单层肠上皮细胞ZO-1、Occludin以及Claudin-1蛋白表达明显降低,并引起ZO-1与Occludin分布明显改变。5.缺氧对单层肠上皮细胞Slingshot-1、Slingshot-3蛋白表达无明显影响,但引起Slingshot-2蛋白表达明显升高。6.Jasplakinolide和Lat A均可引起单层肠上皮细胞TER明显下降,通透性显著增加。7.Jasplakinolide和Lat A均可引起单层肠上皮细胞ZO-1与Occludin蛋白表达明显降低,并引起ZO-1与Occludin分布明显改变。8.Jasplakinolide引起单层肠上皮细胞F-actin/G-actin比值明显升高,尤其在24h升高显著;而Lat A则引起单层肠上皮细胞F-actin/G-actin比值在24h有较明显的降低。9.Jasplakinolide和Lat A处理后,单层肠上皮细胞Cofilin蛋白表达在各时相点均无明显变化,而p-cofilin蛋白表达显著降低。三、结论缺氧后单层肠上皮细胞屏障功能损害明显,其分子机制可能是缺氧通过诱导Slingshot-2蛋白表达,激活Cofilin,引起F-actin解聚以及F-actin与G-actin平衡失调,从而导致TJ蛋白表达降低及分布改变。
【关键词】：缺氧 肠上皮细胞 屏障功能 通透性 丝切蛋白 Slingshot 纤维状肌动蛋白 球状肌动蛋白 紧密连接蛋白 Jasplakinolide Latruculin A
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 缺氧对肠上皮细胞Slingshot介导的Cofilin活化的影响及其与屏障功能损害的关系13-36
• 2.1 材料与方法13-21
• 2.2 实验结果21-33
• 2.3 讨论33-36
• 第三章 肌动蛋白变化在肠上皮细胞屏障功能损害中的作用36-51
• 3.1 材料与方法36-37
• 3.2 实验结果37-49
• 3.3 讨论49-51
• 全文结论51-52
• 参考文献52-55
• 文献综述 丝切蛋白与疾病关系的研究进展55-66
• 参考文献61-66
• 攻读学位期间的研究成果66-67
• 致谢67

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本文编号：1130240