高血氨诱导肝细胞损伤及其代谢组学的研究

发布时间：2018-04-12 10:36

本文选题：肝衰竭 + 肝损伤　；参考：《郑州大学》2015年博士论文

【摘要】：肝衰竭是常见的危重症,死亡率高达70~80%。肝衰竭的发病机制尚不清楚,其治疗仍是世界性难题。在肝衰竭中,存在大量肝细胞坏死,肝功能受损,肝细胞再生和分化障碍,是导致患者死亡的重要原因之一。残存的肝细胞无法满足机体的需要,导致肝细胞的转化和代谢功能紊乱,引发如血氨、乳酸、间接胆红素等代谢产物蓄积。目前“二次损伤”学说是肝衰竭发生发展的重要机制之一,肝衰竭最常见的代谢紊乱---高血氨,其神经毒性已经被众多学者研究,但是它是否会造成肝脏的二次损伤未见相关报道。我们以高血氨为研究肝衰竭的切入点,前期首次建立高血氨攻击大鼠模型,证实高血氨可以诱导大鼠肝脏的“二次损伤”,但是尚未在细胞水平研究高血氨对人肝细胞的损伤作用及其机制。肝脏是人体非常重要的代谢器官,当肝脏出现病理改变,必然伴随与之相关代谢网络的变化。因此研究高血氨对肝细胞损伤机制,不能仅着眼于肝细胞本身的损伤,还需要用整体性思维即系统生物学来研究。高血氨诱导肝损伤的代谢组学研究在国际上鲜有报道。于是研究高血氨诱导肝细胞损伤及其代谢组学,为揭示高血氨在肝衰竭中的分子生物学机制提供理论基础,并为肝衰竭的预防和治疗提供新的干预策略和作用靶点。方法1氨对肝细胞特异性损伤作用首先构建高血氨细胞模型,采用CCK-8法和流式细胞仪检测氨对不同细胞系增殖和凋亡的影响,探讨氨对肝脏细胞的损伤和凋亡作用是否具有特异性。采用Real-time PCR和Western Bloting检测氨转运相关蛋白:Rh C型糖蛋白(Rh family,C glycoprotein,RHCG)和水通道蛋白8(aquaporin-8,AQP8)的表达,探讨其特异性机制。采用电子显微镜和活体细胞线粒体膜通道孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore,m PTP)荧光检测,观察细胞线粒体形态并检测线粒体膜通透性,以探讨其可能的损伤机制。2氨对肝细胞代谢谱的影响建立以气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术为基础的高血氨细胞模型代谢组学方法,了解高血氨对肝细胞代谢谱的影响,结合多元数据分析和比对数据库等方法,筛选并鉴定出差异代谢产物,找出差异代谢通路。根据GC-MS结果提供的相关线索,结合Real-time PCR、Western Bloting等技术对差异代谢通路进行验证和深入研究。结果 1氨对肝细胞具有特异性损伤作用1.1氨对肝细胞增殖和形态的影响以及建模浓度的选择随着氨浓度增加和(或)处理时间的延长,原代肝细胞的生长增殖受到明显的抑制,显微镜下,肝细胞生长密度也随之显著下降并最终出现空泡现象。10 m M的氨浓度是理想的建模浓度。1.2氨对肝类细胞和非肝类细胞增殖和凋亡的影响(1)氨抑制肝类细胞的生长和增殖,尤其是原代肝细胞;对非肝类细胞生长影响不大。(2)氨能明显诱导原代肝细胞凋亡,而对其它类型的细胞凋亡影响不大1.3氨对不同细胞系氨转运蛋白的影响氨能明显影响原代肝细胞氨转运体RHCG、AQP8 m RNA和蛋白的表达,其它细胞系氨转运体的表达不受氨的影响。1.4氨对肝功能酶学指标的影响与对照组相比,高氨细胞模型中谷胱甘肽(glutathione,GSH)呈现先降低然后又恢复正常的趋势,谷氨酸转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)呈现先明显上升后又显著下降的趋势,天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartate transaminase,AST)在最初的48小时之前无明显差异,之后呈现明显升高的趋势。环氧化物水解酶(cyclo-oxygen-ase,COX)在24小时之后呈现明显升高的趋势。1.5氨对肝细胞线粒体损伤和凋亡的影响电镜下高氨环境的肝细胞线粒体出现肿胀、变圆、嵴紊乱和空泡化等形态变化,氨诱导m PTP,增加线粒体通透性。与此同时发现细胞出现凋亡现象。2氨对肝细胞代谢谱的影响1)建立GC-MS检测高氨肝细胞模型代谢谱的方法,通过多元统计分析方法,发现氨处理组与未处理组代谢存在显著差异。2)GC-MS检测到648个代谢产物,找到120个差异代谢产物,并根据相关数据库鉴定代谢产物,找出主要差异代谢通路。结果发现氨处理组三羧酸循环、尿素循环和嘌呤嘧啶通路等均出现代谢障碍。(1)氨对三羧酸循环的影响氨处理组的三羧酸循环代谢产物如柠檬酸、α-酮戊二酸、苹果酸水平都显著降低,并检测到ATP生成减少。(2)氨对尿素循环的影响高氨环境下尿素水平并没有升高,而是与未处理组相比无明显差异。精氨酸水平明显降低,鸟氨酸水平轻度升高。并且检测到尿素循环关键的限速酶同时也是代谢氨的关键酶CPS-I明显受到氨的抑制。而参与氨代谢的另一个重要酶——氨甲酰磷酸合成酶II(carbamoylphosphate synthetase II,CPS-II),即CPS-I的同工酶,其的表达增强。即高氨环境下CPS-I表达减弱,而CPS-II表达增强(3)氨对嘌呤嘧啶代谢的影响在氨处理组中,嘌呤通路代谢产物肌苷、黄嘌呤水平较对照组明显减少;嘧啶通路中乳清酸、尿嘧啶、β-丙氨酸、胞嘧啶、异丁二酸水平与对照组相比也明显减少,而胸苷酸是增多的。乳清酸是核酸合成的重要前体物质,结合Real-time PCR和Western Bloting技术检测并验证催化乳清酸合成的关键酶二氢乳清酸脱氢酶在高氨状态下表达抑制,14C-UTP掺入法检测到RNA的合成障碍。3差异代谢产物对高氨细胞模型的影响与其他差异代谢物相比,乳清酸可以明显逆转氨对肝细胞的损伤作用。其具有促进肝细胞增殖再生,减轻凋亡,提高RNA合成的作用。结论 1.氨对肝细胞具有特异性损伤,其特异性机制与细胞膜上的氨转运的相关蛋白RHCG和AQP8的表达有关,其损伤机制与氨启动线粒体凋亡途径有关。2.氨导致肝细胞三羧酸循环、尿素循环和RNA合成障碍。首次提出在高氨环境下,尿素循环存在障碍,不能有效代谢氨,多余的氨进入由CPS-II参与的氨代谢通路的理论。乳清酸可以明显逆转氨对肝细胞的损伤作用,促进肝细胞再生,它如果和有效促进内源性ATP生成的药物结合应用,可能是未来研发治疗肝衰竭新药物颇具前景的方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.3

【相似文献】