水飞蓟宾抑制NLRP3炎症小体的活化减轻DSS诱导的结肠炎的研究

发布时间：2018-07-04 18:20

本文选题：水飞蓟宾 + NLRP3炎症小体　；参考：《天津医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：目的炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种病因尚不完全清楚的慢性肠道非特异性炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn`s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),其具有治疗困难、易复发及易癌变等特点,给患者带来长期反复的巨大痛苦。近年来其发病率在全球范围内逐渐上升,并且尽管随着治疗及预防措施的不断发展,仍有许多患者需要接受手术治疗,给人类健康带来巨大的威胁。近年来研究发现,水飞蓟宾(silibinin,SB)作为一种植物提取物,具有抗炎抗癌的作用,但其对结肠炎的作用及机制尚未完全阐明。NLRP3炎症小体是一种由NLRP3、含有CARD结构域的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD,ASC)和caspase-1共同组成的分子量大于700k D的多蛋白复合物。NLRP3炎症小体可被多种因素激活,如微生物核糖核酸(RNA)、ATP、颗粒物或细胞成孔毒素等,活化的NLRP3炎症小体可使无活性的casepase-1前体活化,促使pro-白细胞介素-1β(pro-interleukin-1β,proIL-1β)、pro-IL-18等细胞因子前体成熟,从而促进细胞因子的释放,在炎症感染的固有免疫应答中起重要作用。本研究以葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的小鼠结肠炎模型为研究对象,旨在探讨植物性药物水飞蓟宾对DSS诱导的结肠炎的作用及其对NLRP3炎症小体的调节作用,为发现IBD的预防及治疗的新靶点提供实验依据。方法本研究选用48只SPF级8周龄的C57BL/6小鼠,随机分为三组:空白对照组8只,DSS组20只,水飞蓟宾治疗组(DSS+SB组)20只。所有小鼠先给予正常饮食饮水7天,以便其适应环境改变,随后7天空白对照组仍给予正常饮食饮水;DSS组给予2%DSS饮水及0.2ml/只/天溶剂(蒸馏水+0.5%羧甲基纤维素)灌胃;DSS+SB组给予2%DSS饮水及750mg/Kg水飞蓟宾灌胃,每天灌胃一次,实验时长共14天,第14天夜间禁食禁水,于第二天处死。从第7天开始,每天测量小鼠体重,观察小鼠排便情况和粪便性状,并留取粪便样本,利用疾病活动指数(Disease activity index,DAI)评分评价小鼠炎症活动变化。小鼠处死后,取出结肠组织并冲洗干净,测量结肠长度。HE染色观察结肠组织炎症表现并用组织学损伤评分评价结肠炎症损伤程度变化。利用Realtime-PCR技术检测小鼠肠道IL-1β、IL-6等促炎因子的表达。应用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖(fluoresceinisothiocyanate-conjuagted dextran,FITC-D)检测小鼠肠道通透性,利用Realtime-PCR技术检测小鼠肠道紧密连接蛋白(claudin-1等)、杯状细胞分泌物粘蛋白MUC2等的基因表达,以评价小鼠肠道黏膜屏障功能的变化。采用免疫荧光染色的方法检测小鼠结肠组织总巨噬细胞表面分子F4/80的表达,采用Realtime-PCR检测炎症小体组成部分NLRP3、ASC和caspase-1的基因表达情况,利用Western blot技术检测炎症小体组成部分NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白表达情况,以评价水飞蓟宾对NLRP3炎症小体活动的影响。结果1.DSS给药期间,大多数小鼠耐受尚可,给药结束时DSS组小鼠死亡5只,DSS+SB组小鼠死亡4只。两组小鼠体重均逐渐下降,而DSS+SB组下降趋势小于DSS组,并于第5天两组差异出现统计学意义(17.65±0.16g vs 18.36±0.26g,P0.05),随后差异无统计学意义。2.水飞蓟宾有效缓解结肠炎引起的结肠长度的缩短[(4.78±0.14)vs(5.34±0.14)cm,P0.01],降低DAI评分,并于第5天[(8.74±0.45)vs(6.73±0.72),P0.05]、第6天[(9.39±0.32)vs(7.90±0.59),P0.05]、第7天[(10.44±0.34)vs(8.53±0.56),P0.01]时,差异有统计学意义。HE染色及组织学损伤评分也显示水飞蓟宾可缓解DSS引起的炎症反应,评分差异存在统计学意义[(11.40±0.31)vs(7.31±0.50),P0.001]。3.与DSS组相比,DSS+SB组小鼠血清中FITC-D的浓度明显较低,且差异具有统计学意义[(4.28±0.55)vs(2.26±0.22),P0.01],表明水飞蓟宾可改善结肠炎时的肠道通透性。同时,DSS+SB组小鼠结肠组织中claudin-1,occludin和MUC2表达均增多,差异存在统计学意义,表明水飞蓟宾可改善结肠炎时的肠道屏障功能。4.与DSS组相比,DSS+SB组结肠组织中IL-1β和IL-6表达均降低,差异有统计学意义;免疫荧光染色显示DSS+SB组总巨噬细胞表面分子F4/80较DSS组明显减少,表明水飞蓟宾能减少巨噬细胞浸润,并有效缓解结肠炎症反应。5.Realtime-PCR显示DSS+SB组炎症小体组分NLRP3、ASC和caspase-1的表达较DSS组降低,且Western blot显示DSS+SB组NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达量也低于DSS组,差异均有统计学意义。结论水飞蓟宾可通过抑制NLRP3炎症小体的活化降低炎症因子产生及释放,保护肠道黏膜屏障功能,从而对DSS诱导的结肠炎发挥保护作用。
[Abstract]:The inflammatory bowel disease ( IBD ) is a kind of chronic intestinal non - specific inflammatory disease , including Crohn ' s disease ( CD ) and ulcerative colitis ( UC ) . The expression of IL - 1尾 , ASC and caspase - 1 in colonic tissues of mice was assessed by immunofluorescence staining . In the DSS + SB group , the levels of IL - 1尾 and IL - 6 in DSS + SB group were significantly lower than those in DSS group .
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R574

【参考文献】