亚硝酸盐干预对慢性酒精性肝纤维化小鼠纤维增生和分布的影响

  本文关键词：亚硝酸盐对慢性酒精性肝纤维化的干预作用，由笔耕文化传播整理发布。

            胶原纤维在 HE 染色法被染成粉红色，这些往往跟淀粉样物难以区别，因为它还可以用一些阴离子的染料来进行染色，如用淡绿可把它们染为绿色，用甲苯胺蓝可将其染为蓝色，Masson 法染色原理与阴离子染料分子的大小和组织的渗透性有关，可将胶原纤维染为蓝色或绿色，组织的渗透性取决于组织的结构密度。组织和细胞成分都是多孔的构造，不同组织和细胞成分空隙大小不同，空隙大小决定组织渗透性。Masson 染色液中酸性品红属于小分子物质，可进入固定后的正常红细胞和肝细胞，而其中的苯胺蓝属于大分子物质，可进入细胞膜肿胀的细胞和新形成的胶原纤维中。本研究预实验时通过灌胃给小鼠酒精 10W，就发现了部分小鼠明显的肝脂肪变性和纤维组织增生。
         为了研究慢性酒精暴露对肝脏纤维化或硬化的影响，本实验进行了为期 20 W（5 个月）的慢性酒精灌胃，同时用亚硝酸盐灌胃干预，，结果如图 3-4 Masson 染色显示,对照组和单纯亚硝酸盐处理组肝细胞被酸性品红染成红色，未见纤维组织增生；模型组小鼠局部肝细胞肿大，肝细胞局灶性坏死常见，坏死的肝细胞被浸润的炎症细胞取代，肿大的肝细胞浆被苯胺蓝染成蓝灰色，肝小叶内可见大量胶原纤维增生，编织成束，分割肝小叶，形成许多假小叶（图 3-4 C 假小叶中央静脉偏位，肝细胞肿胀，细胞质疏松）；与模型组相比，亚硝酸盐干预组肝细胞大小基本正常，细胞质被苯胺蓝着色浅，可见肝小叶内有少量胶原纤维。3.7 亚硝酸盐干预对慢性酒精性肝纤维化小鼠肝细胞上皮间质-转化的影响正常的肝细胞内含有丰富的白蛋白，不含有纤维特异性蛋白，而肝星形细胞可转化为成纤维细胞，细胞之内含有纤维特异性蛋白，利用白蛋白和纤维特异性蛋白免疫荧光染色可区分肝细胞和肝内星形细胞及成纤维细胞。
         图 3-5 显示的是用白蛋白（绿色荧光）和纤维特异性蛋白（红色荧光）标记的免疫荧光双标记激光共聚焦图片。对照组肝细胞质内白蛋白丰富，未显示红色荧光，肝内星形细胞呈红色荧光，散落于肝细胞之间，未与肝细胞共定位。在模型组可见肝细胞内绿色荧光强度减弱，意味着肝细胞白蛋白合成明显较少，许多区域的肝细胞质内出现红色荧光，这意味着肝细胞内存在纤维特异性蛋白，也就是说肝细胞获得了一定的间质纤维细胞表型。在亚硝酸盐干预组，肝细胞内白蛋白含量高于模型组，肝细胞内红色和绿色荧光共定位的现象也较模型组少见。为了进一步验证慢性酒精暴露对肝细胞上皮间质转化的影响，本课题利用免疫荧光双标记法进一步检测了肝组织内 E-cadherin 和 Vimentin 表达情况。结果如图 3-6 所示，可见对照组 E-cadherin 分布均匀，仅在星形细胞内可见 Vimentin 蛋白表达。在模型组，大部分正常肝细胞表达 E-cadherin，而位于汇管区周边的部分肝细胞 E-cadherin 表达明显减少，而在这些肝细胞内有 Vimentin 表达，另外可见大量星形细胞增生。在亚硝酸盐干预组，星形细胞数量以及同一肝细胞内E-cadherin 表达下降，Vimentin 表达升高的现象较模型组减少。
          为了进一步验证亚硝酸盐对慢性酒精性肝纤维化的干预作用，本实验又将部分新鲜肝组织标本匀浆，提取蛋白质，用 western blotting 方法检测了纤维特异性蛋白的表达，结果如图 3-7，亚硝酸盐可以明显减轻肝组织内胶原纤维的含量。3.8 亚硝酸盐干预对慢性酒精性肝纤维化小鼠肝细胞 HIF-1α蛋白表达的影响为了了解慢性酒精暴露对肝脏组织内造成的缺氧情况，本课题利用免疫荧光技术检测了缺氧标志物 HIF-1α 蛋白的表达情况，结果如图 3-8 所示，对照组和单纯亚硝酸盐组肝细胞内有微弱的绿色荧光，显示 HIF-1α 蛋白的表达不强；在模型组，可见汇管区一些肝细胞内出现较强的绿色荧光，提示这些细胞内 HIF-1α蛋白累积，而亚硝酸盐干预组这种情况虽然存在，但相对模型组要轻。

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