Mfn2通过调控TGF-β抑制大鼠腹主动脉慢性排斥反应及肝纤维化

发布时间：2019-01-07 12:31

【摘要】：背景：慢性排斥反应属于迟发型变态反应,一般发生在移植后半年或数年后,呈进行性发展,其病因及机制错综复杂,不十分清楚,多由反复发作的急性排斥反应所造成。慢性排斥反应的病理特点为退行性及破坏性改变,表现为血管内膜平滑肌细胞、间质纤维组织增生及单核巨噬细胞浸润。慢性排斥反应有一个共同组织学表现即移植物动脉硬化,移植物动脉硬化早期即有明显的VSMC凋亡,并且VSMC凋亡与血管内膜增厚、移植物动脉硬化相关,其特征是泡沫细胞性闭塞性动脉病变,如动脉内膜增厚、内膜的单核细胞和巨噬细胞浸润及间质纤维化。Mfn2基因,又称为增殖抑制基因(HSG),它的表达产物抑制VSMC增殖的同时能诱导VSMC从处于增殖状态的去分化型向分化型转化,即HSG/Mfn2参与VSMC再分化过程。并且高表达的HSG/Mfn2基因能促进大鼠的血管平滑肌细胞(VSMC)的凋亡。但Mfn2在移植慢性排斥反应中的功能及变化尚未有相关报道。肝纤维化是指由于细胞外基质的形成和降解的平衡失调导致肝内纤维组织的积累,是许多纤维组织包围的再生结节引起的肝脏结构的广泛破坏。肝纤维化是肝脏纤维结缔组织的过度沉积,是纤维增生和纤维分解不平衡的结果。Mfn2作为一种新型的增殖抑制因子,已有研究表明其能抑制血管平滑肌细胞增殖,减少血管内膜弹性纤维组织的增多。同时,也已有相关文献报道在糖尿病肾病模型中,Mfn2高表达可以抑制肾间质纤维化,降低胶原4的表达。但是Mfn2对肝脏纤维化的影响尚未有相关报道。目的：本实验拟通过研究Mfn2对大鼠腹主动脉移植慢性排斥反应的影响以及在肝纤维化过程中的变化,探索Mfn2在纤维化过程中所起的作用以及可能的作用机制,为肝硬化的治疗和移植术后降低慢性排斥反应提供一定帮助。方法： 1.构建Mfn2-GFP漫病毒,并转染供体Lewis大鼠移植段腹主动脉。 2.将转染Mfn2-GFP的供体Lewis大鼠移植段腹主动脉移植到受体Bn大鼠的相应位置腹主动脉段,并设立转染GFP慢病毒的阴性对照组。 3.分别于30天、60天、90天取下移植段血管,用HE染色法和masson染色法观察血管内膜增厚程度。并采用免疫组化测定Mfn2和慢性排斥反应相关因子TGF-β1、TGF-βR2的关系。 4.门静脉注射Mfn2-GFP'慢病毒转染大鼠肝脏,并通过CC14构建大鼠肝硬化模型。 5.8周后取肝脏行HE和masson染色观察肝脏形态,并利用western、免疫组化等技术检测其中Mfn2与纤维化相关因子TGF-β1、TGF-βR2、Smad3、Smad4、 Smad7、胶原Ⅳ、α-SMA的表达量关系。 6.用Mfn2慢病毒转染大鼠肝星状细胞,利用western检测其中Mfn2与纤维化相关因子TGFβ1、TGFβR2、Smad3、Smad4、Smad7.胶原Ⅳ的相互关系。 7.CCK8、细胞凋亡、迁移实验检测稳转Mfn2的肝星状细胞的增殖情况。结果： 1.通过masson染色和imagepro-plus6.0软件测量移植段大鼠腹主动脉内膜厚度,结果提示,移植后60天和90天,转染Mfn2-GFP的腹主动脉内膜厚度明显小于转染GFP的腹主动脉内膜厚度(p0.001)。 2.免疫组化结果证实移植后60天和90天,转染Mfn2-GFP的腹主动脉内膜的TGF-β1、TGF-pR2的表达量要低于转染GFP的腹主动脉内膜(p0。01)。 3. Masson染色结果提示：行cc14造肝硬化模型时,2周即可出现明显脂肪空泡,但肝脏结构尚正常；4周时开始出现小叶内变性、融合坏死,纤维间隔伴小叶结构紊乱；6周出现较大范围的桥接坏死,累及多个小叶,小叶结构失常,纤维间隔小于O.1mm,但纤维结节直径大于2mmm；8周出现较大范围的桥接坏死,累及多个小叶,小叶结构失常,纤维间隔小于0.1mm,但纤维结节直径小于1mm。同时masson染色提示,门静脉注射Mfn2-GFP'慢病毒的大鼠肝脏行ccl4造模8周后,纤维化程度与6周肝硬化模型无明显差别(P0。05),低于8周肝硬化模型(P0.05)。 4.WB和免疫组化结果提示,肝硬化组Mfn2表达量小于对照阴性组和转染Mfn2病毒组(p0.05),同时TGF-β1ΟTGF-βR2、Smad3、Smad4和胶原4表达量大于后两者(p0.05),提示Mfn2有抑制肝纤维化作用,且有可能是通过参与TGFβ-Smad通路降低肝纤维化。结论： 1.转染Mfn2的移植段腹主动脉内膜厚度明显小于转染GFP组,同时免疫组化提示前者TGFβ1和TGFβR2表达量皆小于后者,提示Mfn2可能通过调控TGFβ1降低移植物慢性排斥反应。 2.Mfn2可以抑制肝纤维化过程,且有可能是通过参与TGFβ-Smad通路降低肝纤维化。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2

【参考文献】