脂联素对内皮素-1诱导的肝星状细胞收缩的影响及作用机制研究

发布时间：2019-04-20 11:43

【摘要】：背景： 慢性肝病时，通常处于静息状态的肝星状细胞(Hepatic Stellate Cells，HSCs)被激活，表型发生转变，转化为肌成纤维细胞，产生大量细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)，表达α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA)，收缩性增强，促进了肝纤维化的发生与发展。HSCs的收缩功能在调节肝窦血流量和肝内血管阻力方面起着重要作用，与肝硬化门脉高压的发生有密切的关系。内皮素-1(endothelin-1，ET-1)是最显著引起HSCs收缩的物质。肝窦收缩和肝内血流阻力升高主要与ET-1引起HSCs的收缩有关。因此，针对活化的HSCs的收缩功能进行调节将有可能会成为肝硬化门脉高压治疗的新途径。脂联素是脂肪细胞分泌的一种脂肪细胞因子，近年来研究发现它具有预防肝纤维化的作用。我们前期实验结果显示，脂联素能够通过激活AMPK途径明显上调诱导型一氧化氮合酶(induciblenitric oxide synthase，iNOS)的蛋白表达、增加一氧化氮(nitric oxide，NO)的合成而对HSC-T6细胞的增殖、迁移具有抑制作用。然而，脂联素是否可以影响HSCs的收缩，其机制是否与调节ET-1表达及相互作用相关，这些研究对进一步揭示其在门脉高压的肝内血管阻力的变化机制具有重要的临床意义，此方面的研究国内外尚未见报道。 目的： 本实验以活化的大鼠HSCs(HSC-T6细胞系)为研究对象，观察脂联素与ET-1共同作用下的HSCs收缩的情况，检测外源性脂联素对HSCs的ET-1的基因及生物学特性有何影响，探讨脂联素对ET-1诱导的HSCs收缩的影响及可能的作用机制，为脂联素降低肝硬化门脉高压提供新的理论依据。 方法： 1.脂联素、ET-1及脂联素与ET-1共同作用下对HSC-T6收缩的影响：应用胶原晶格法检测HSC-T6的收缩，收集对数生长期的HSC-T6，将细胞混悬液接种于预先制备好的胶原凝胶上，将细胞同步化后分别加入相关药物进行干预试验，分为6组：A.空白对照组；B.脂联素(0.5μg/mL)组；C.ET-1(10nmol/L)组；D.脂联素(0.25μg/mL)+ET-1(10nmol/L)组；E.脂联素(0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)组；F.脂联素(0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)+L-NAME (5mmol/L)组。通过观察细胞胶原凝胶剥离后24h时的大小，，判断各组的HSC-T6的收缩情况。 2.检测脂联素对活化的HSC-T6细胞系ET-1分子生物学的影响：(1)实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组HSC-T6中ET-1mRNA的表达；(2) Western blot检测各组HSC-T6中ET-1蛋白的表达；(3)采用ELISA检测各组培养上清液中ET-1蛋白的表达。实验分组：A.空白对照组；B.脂联素(0.5μg/mL)组；C.脂联素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)组。 3.探讨脂联素影响ET-1诱导的HSCs收缩的信号传导机制：分别采用qRT-PCR及Western blot检测不同浓度的脂联素与ET-1共同作用下HSC-T6细胞中iNOS的mRNA及蛋白水平的表达。采用Western blot检测不同浓度的脂联素与ET-1共同作用下HSC-T6细胞中AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt蛋白水平的表达。实验分组：A：空白对照组；B：ET-1(10nmol/L)组；C：Adiponectin (0.5μg/mL)+ET-1(10nmol/L)组；D：Adiponectin (1μg/mL)+ET-1(10nmol/L)组；E：Adiponectin(2μg/mL)+ET-1(10nmol/L)组。 结果： 1.通过胶原晶格实验显示：ET-1(10nmol/L)可导致HSC-T6明显收缩，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P0.01)；脂联素可以抑制ET-1诱导的HSC-T6收缩，并呈浓度依赖性，0.5μg/mL脂联素能明显抑制ET-1(10nmol/L)引起的HSC-T6收缩，与ET-1组相比差异有统计学意义(P0.01)；L-NAME (5mmol/L)可以部分抵消脂联素(0.5μg/mL)对ET-1(10nmol/L)引起HSC-T6收缩的抑制作用，与ET-1组相比差异有统计学意义(P0.05)。 2.通过qRT-PCR定量检测HSC-T6细胞中ET-1mRNA的表达水平：与空白对照组相比，脂联素(0.5μg/mL)组ET-1的mRNA表达水平显著下降(P0.05)，而脂联素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)组中出现ET-1mRNA表达的下降，但与空白对照组相比无显著性差异(P＞0.05)；通过Western blot法检测HSC-T6细胞中ET-1蛋白的表达：与空白对照组相比，脂联素(0.5μg/mL)组ET-1的蛋白表达明显下降(P0.05)，脂联素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)组ET-1的蛋白表达略有下降，但无统计学差异(P＞0.05)；通过ELISA法检测细胞培养液中ET-1蛋白的表达：与空白对照组相比，脂联素(0.5μg/mL)组ET-1的蛋白表达明显下降(P0.05)，脂联素(0.5μg/mL)+L-NAME (5mmol/L)组ET-1的蛋白表达有所下降，但无统计学差异(P＞0.05)。 3.通过qRT-PCR法检测iNOS mRNA的表达量：HSC-T6细胞中有iNOSmRNA表达，加入ET-1(10nmol/L)后iNOS mRNA表达量明显下降(P0.01)，同时加入ET-1(10nmol/L)和脂联素(0.5μg/mL)作用后iNOS mRNA表达较ET-1组增加，且随着脂联素浓度升高iNOS mRNA表达量有逐渐升高的趋势；Western blot法检测发现HSC-T6细胞中iNOS蛋白表达与mRNA表达趋势一致。通过Western blot法检测AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt的蛋白表达水平，结果显示：对照组中p-AMPK有轻微表达， ET-1(10nmol/L)组p-AMPK几乎无表达，ET-1(10nmol/L)+脂联素(0.5μg/mL)组p-AMPK有表达，且随着脂联素浓度升高p-AMPK表达逐渐增强，而各实验组之间总AMPK表达无明显差异。各实验组之间总Akt表达无明显差异，ET-1(10nmol/L)组p-Akt的表达量明显升高，而ET-1(10nmol/L)+脂联素(0.5μg/mL)组p-Akt的表达下降，且随着脂联素浓度升高p-Akt的表达量有逐渐减低的趋势。 结论： 1、脂联素能够抑制ET-1诱导的HSCs收缩。 2、脂联素在mRNA及蛋白水平抑制了活化的HSCs中ET-1的合成，并且抑制HSCs自分泌ET-1。 3、脂联素抑制ET-1诱导HSCs的收缩可能是通过激活AMPK，从而提高HSCs细胞内的NO水平以及阻断Akt信号通路实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575.2

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 查棠春;王德英;;1例酒精性肝硬化伴戒酒综合征的护理[J];安徽医药;2009年12期

2 周辉;杨树清;刘君俊;沈金勇;;腹水超滤浓缩回输联合静脉输入人血白蛋白、利尿治疗顽固性腹水疗效观察[J];北方药学;2011年05期

3 谷峰;陈宾;向荣;田亚平;;肝脏疾病患者血清酶活性与凝血四项的变化规律及辅助诊断价值研究[J];标记免疫分析与临床;2011年04期

4 宋春霞;张伯鹏;李炎;阎志欣;;恩替卡韦治疗乙型肝炎肝硬化伴肝源性糖尿病临床疗效观察[J];重庆医学;2010年13期

5 谭妹莲;陈波林;;16例吸毒致丙型肝炎患者的临床护理[J];当代护士(学术版);2005年12期

6 罗凤琳;;肝硬化合并上消化道出血临床分析[J];当代医学;2011年02期

7 张建成;沈艳平;;48例肝硬化并上消化道出血临床诊治分析探讨[J];当代医学;2011年06期

8 郭怡萍;;重症监护对上消化出血治疗结果的影响研究[J];当代医学;2012年11期

9 张玉臣,高得勇,孙洁;病毒性肝炎临床分型与病理诊断分析[J];实用肝脏病杂志;2005年05期

10 冯静;孙艳梅;许传娟;;乙型肝炎肝硬化合并肝源性糖尿病的治疗[J];实用肝脏病杂志;2007年04期

中国重要会议论文全文数据库 前3条

1 张珍;;重症肝炎血浆置换术的护理进展[A];第二届全国人工肝及血液净化学术年会论文集[C];2005年

2 张治国;杨杰;张智;向丽华;;舌象与肝病关系临床研究集析[A];中国中西医结合学会诊断专业委员会2009’年会论文集[C];2009年

3 刘春文;周观林;王利勤;黄云秀;曾敬科;梁斌;罗颖敏;杨沛华;蔡志诚;陈怡文;;复方丹参滴丸联合熊去氧胆酸片治疗残留黄疸疗效观察[A];江西省第三次中西医结合肝病学术会议暨江西省中西医结合肝病新进展学习班论文汇编[C];2012年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 贾爱芹;清肝抑纤饮及其拆方防治大鼠肝纤维化的实验研究[D];山东中医药大学;2010年

2 黎宁钦;小型猪肝纤维化模型制备及MSCTP研究[D];广西医科大学;2007年

3 廖锦元;MSCT评价小型猪终末期肝病肝功能储备实验研究[D];广西医科大学;2010年

4 罗亚萍;手机频率电磁辐射对大鼠肝脏的影响及西洋参胶囊对其干预作用的研究[D];河北医科大学;2014年

本文编号：2461578