16个氨基酸多肽对伴刀豆蛋白A诱导的急性免疫性肝损伤的作用及其机制的初步研究

发布时间：2019-04-28 07:13

【摘要】：目的：病毒感染、自身免疫状态、酒精的摄入及一些特定药物的使用，均可以导致肝炎的发生，而且易进展为肝硬化、肝衰竭或肝癌。尽管目前有许多治疗方法可以促进肝功能的恢复，但是仍有很大比例的肝炎患者对于治疗无有效应答，甚至有些患者最终需要进行肝脏移植手术。伴刀豆蛋白A（Concanavalin A, ConA）诱导的小鼠肝损伤模型可以较好地模拟人类病毒性肝炎、自身免疫性肝炎和急性肝衰竭的病理生理学。经Con A刺激可导致小鼠肝细胞坏死和凋亡，伴随血清丙氨酸转氨酶（alanineaminotransaminase, ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）升高，并且有大量的T细胞、NKT细胞和Kuffer细胞等淋巴细胞向肝脏浸润。本室前期研究发现16个氨基酸多肽在轻中重度慢性乙肝患者血清中有差异性表达，且通过体外实验证实16个氨基酸多肽有促进肝细胞增殖的作用。本研究通过建立ConA诱导的肝损伤模型，来探讨外源性给予人工合成的16个氨基酸多肽对急性免疫性肝损伤的作用，并对其机制进行初步研究。方法： 116个氨基酸多肽预防性给药对Con A诱导肝损伤的作用：将56只雄性6-8周龄Balb/c小鼠随机分为7组，除正常对照组给予2次生理盐水外，各组小鼠分别经尾静脉给予0.25ml NS，500μg/kg体重地塞米松或200、400、800、1600μg/kg体重16个氨基酸多肽，1h后经尾静脉注射12mg/kg体重Con A，注射Con A12h后处死小鼠进行后续实验。 216个氨基酸多肽治疗性给药对Con A诱导肝损伤的作用：将32只小鼠随机分成4组，除正常对照组注射2次生理盐水外，其他各组小鼠经尾静脉注射12mg/kg ConA，，30min后，分别经尾静脉给予0.25ml NS，500μg/kg体重地塞米松或者800μg/kg体重16个氨基酸多肽。12h后处死小鼠，进行后续实验。 316个氨基酸多肽对致死剂量Con A诱导肝损伤小鼠生存率的影响：将60只小鼠随机分为两大组，即预防性给药组和治疗性给药组，每组30只。然后再将每个大组随机分为3组，每组10只。各组均于尾静脉注射致死剂量25mg/kg体重ConA1h前（预防性给药）或30min后（治疗性给药）分别经尾静脉注射0.25ml NS、500μg/kg体重地塞米松或800μg/kg体重16个氨基酸多肽，观察ConA注射后72小时内小鼠的生存情况，每小时记录一次。 4血清ALT和AST检测：于Con A刺激后12h收集小鼠血液，分离血清，采用全自动生化分析仪检测血清ALT和AST水平。 5肝组织病理学检测:经Con A刺激后12h分离肝脏，于同一位置取合适大小的肝组织进行固定，石蜡包埋，行5μm连续切片后进行HE染色，于光学显微镜下观察肝组织病理学形态，并采集图像。 6肝细胞凋亡和肝细胞周期检测: Con A注射后12h，分离肝组织，应用酶消化法分离肝细胞，经PI染色后采用流式细胞仪分析肝细胞凋亡和细胞周期。 7肝组织各淋巴细胞浸润比例检测: Con A刺激后12h，分离肝组织，应用密度梯度离心法分离淋巴细胞，经FITC-CD3e-Ab和PE-DX5-Ab标记后采用流式细胞仪分析肝脏T细胞、NK细胞、NKT细胞浸润情况。结果： 116个氨基酸多肽预防性给药对Con A诱导肝损伤的影响：经Con A刺激12h后，ConA模型组小鼠血清ALT和AST水平显著高于正常对照组（均P0.001）；不同剂量16个氨基酸多肽预防性给药均显著降低了血清ALT和AST水平（均P0.05），并且存在剂量反应关系，800μg/kg剂量组效果最好；地塞米松预防性给药也显著降低了血清ALT和AST水平，与16个氨基酸多肽800μg/kg剂量组相比，差异无统计学意义。组织病理学结果可见，ConA模型组小鼠肝组织出现大量肝细胞坏死，而各剂量16个氨基酸多肽预防性给药及地塞米松预防性给药均能使之显著改善，未见明显坏死。 216个氨基酸多肽预防性给药对注射致死剂量Con A小鼠生存率的影响：800μg/kg体重16个氨基酸多肽或地塞米松预防性给药均可以显著改善Con A诱导肝损伤小鼠的生存情况，生存率由20%分别提高至70%和80%（P值分别为0.01和0.004），中位生存时间由11h均延长至72h。 316个氨基酸多肽预防性给药对Con A诱导肝细胞凋亡的影响：ConA模型组小鼠凋亡肝细胞比例为30.25±1.29%，显著高于正常对照组的5.32±0.58%（P0.001）；各剂量的16个氨基酸多肽预防性给药组凋亡肝细胞百分比分别为8.72±0.60%，5.88±2.98%，5.45±1.96%和4.68±1.10%，均显著低于Con A模型组（均P0.001）；地塞米松预防性给药也显著减少肝细胞凋亡至8.40±2.02%（P0.001），但效果较16个氨基酸多肽1600μg/kg剂量组略差（P0.05）。 416个氨基酸多肽预防性给药对Con A诱导肝损伤小鼠肝细胞周期的影响：除200μg/kg体重16个氨基酸多肽预防性给药组肝细胞周期与Con A模型组差别无统计学意义外，其他剂量16个氨基酸多肽预防性给药组G2/M期肝细胞百分比较模型组增多（均P0.01），G1期肝细胞百分比较模型组减少（均P0.05）。地塞米松预防性给药组G1期肝细胞百分比明显增多，S期和G2/M期肝细胞百分比均下降（均P0.01）。 516个氨基酸多肽预防性给药对Con A诱导的肝组织各淋巴细胞浸润比例的影响：Con A模型组小鼠肝组织内T细胞和NKT细胞显著多于正常对照组（均P0.05），而400，800μg/kg体重16个氨基酸多肽预防性给药组（均P0.01）与地塞米松预防性给药组（P0.001）均可以显著减少T细胞和NKT细胞所占比例。 616个氨基酸多肽治疗性给药对Con A诱导肝损伤的影响：Con A刺激后给予800μg/kg体重16个氨基酸多肽或地塞米松治疗均显著降低了血清ALT和AST水平（均P0.001），同时也改善了肝细胞坏死情况。 716个氨基酸多肽治疗性给药对注射致死剂量Con A小鼠生存率的影响：800μg/kg体重16个氨基酸多肽或地塞米松治疗改善了小鼠生存情况，将生存率由20%提高至40%和60%（P值分别为0.029，0.011）。中位生存时间由13h延长至37h和72h。结论： 1外源性给予16个氨基酸多肽可以有效预防和治疗Con A诱导的肝损伤，并且可以改善注射致死剂量ConA小鼠的生存情况。 2外源性给予16个氨基酸多肽对Con A诱导肝损伤的保护性作用可能与其抑制肝细胞凋亡，促进肝细胞增殖，抑制T细胞、NKT细胞向肝组织浸润有关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R575

【引证文献】