组蛋白乙酰转移酶MOF在炎性疾病中的调控作用

发布时间：2019-08-28 13:19

【摘要】：炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD),是一种遗传因素、环境因素和免疫因素共同参与的肠道非特异性炎性疾病。其中,UC是一种主要累及肠道黏膜层,以弥漫性黏膜炎症和溃疡性病变为特点的慢性肠炎。其发病机制目前尚不清楚,治疗进展缓慢且缺乏特异性,发病率在我国有逐年上升的趋势。我国溃疡性结肠炎的患病率为11.6/10万,并且已成为消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因,且患者多为青壮年,因此日益受到重视。葡聚糖硫酸钠(Dextran sulfate sodium, DSS)是一种硫酸多糖体,能诱发UC。其机制可能与免疫细胞功能失调、肠道菌群失调有关。目前已有研究表明,IBD不仅与遗传因素有关,还与DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传调控有关,这些均可以调节炎症相关的基因的功能。多发性硬化(Multiple sclerosis, MS),是一种中枢神经脱髓鞘自身免疫病。多发生在青年人群中的。在我国发病率为万分之五。多发性硬化病人的临床表现症状主要有视神经受损导致的视力下降,肢体行动不协调,大小便失禁等。由于其症状较为严重而且容易复发所以日益受到广泛的关注。实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是模仿人类MS的经典动物模型。有研究表明CD4+CD25+Treg细胞在EAE小鼠神经中枢高表达,并且通过局部免疫抑制调控EAE的发展。Mo他叫MYST1,是一种组蛋白乙酰转移酶,它能将组蛋白H4的第16位赖氨酸(H4K16)乙酰化,Mof也可以乙酰化非组蛋白p53、TIP5等,乙酰化可以激活基因转录。Mof在正常的细胞增殖、分化、胚胎发育、DNA损伤修复、肿瘤发生过程中起着不可替代的重要作用。研究表明Foxp3可以协助Mof完成激活靶基因转录的功能。肿瘤坏死因子TGF-β在Mof的作用下刺激Foxp3基因的活化,表达Foxp3。因此,研究Mof对Treg细胞的调控作用可以使我们更深入的了解自身免疫疾病的发病机制。研究目的：通过动物模型即利用C57BL/6小鼠分别饮用3.5%的DSS溶液建立急性UC模型和体内注射MOG35-55多肽抗原建立EAE模型。通过形态学,组织病理学,分子生物学,细胞化学等试验检测方法,观察UC发病小鼠肠黏膜组织与对照组相比发生的各种变化。对比EAE发病不同时期与正常组的区别。进而探讨组蛋白乙酰转移酶Mof在自身免疫病发病机制中的有关作用,为人类自身免疫疾病的预防与临床治疗提供理论依据。研究方法：选取同一窝出生的且体重相近的6.8周的雌性C57BL/6小鼠作为材料,随机且平均分成两组,每组至少3只进行以下实验：1.选取其中两组小鼠分别用于建立急性UC模型和EAE模型。2.其中UC实验组分为DSS诱导3天和7天两小组,收集相同部位的结肠组织,用于后续实验；EAE实验组分为发病初期、高峰期和缓解期三个时期,收集脾脏组织。3.观察正常组与UC实验组小鼠结肠的区别和EAE实验组小鼠与对照组运动能力的区别,确定模型构建成功。4.细胞化学染色观察DSS诱导3天和7天的组织病理学变化及严重程度。5.结肠组织切片进行免疫荧光双染,观察组蛋白乙酰转移酶Mof和Tregs关键转录因子Foxp3的表达情况,并进行组织、细胞中的定位。6.UC实验组与对照组和EAE实验组与对照组的组织分别用TRIzol裂解细胞提取细胞总RNA, qPCR扩增,定量分析炎症有关基因与免疫因子的相对表达量。7.从两个实验组和对照组小鼠组织中提取总蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳分析Mof,Foxp3蛋白的表达变化情况。8. Co-Immunoprecipitation (Co-IP)验证Mof与Foxp3有无物理上的相互作用。9.染色质免疫共沉淀(ChIP-qPCR)实验分析小鼠组织中Mof在特定基因启动子区域的结合状况,从而探讨自身免疫病及炎症的发病机制。10.结直肠癌细胞HCT116细胞中过表达Mof,确定Mof对相关基因的调控作用。实验结果：1.形态学观察：分离C57BL/6小鼠的结肠组织,观察UC实验组与对照组相比,结肠长度明显缩短,并且结肠有出血现象,且7天的组织变化更明显,结肠内部明显的观察到血便；EAE实验组小鼠行走缓慢,尾部无力,甚至出现双后肢瘫痪。2.组织的病理切片：用苏木精伊红染色的方法鉴定,DSS饮用组小鼠的结肠粘膜层发生细胞凋亡,并伴有严重的黏膜脱落现象。3.免疫荧光双染发现组蛋白乙酰转移酶Mof表达于结肠组织固有层细胞的细胞核中,并且与Foxp3蛋白共定位。4.Mof, Foxp3,Il17, Tlr3, Tlr4, Tlr5, Tlr6, Tlr7, Tlr9 mRNA活性水平的变化,以18srRNA为参照,定量分析。DSS饮用7天的小鼠结肠组织其Mof, Foxp3,1117的mRNA表达明显高于对照组,Tlr4, Tlr6, Tlr9 mRNA表达水平也显著高于对照组。DSS饮用3天的小鼠结肠组织中,Mof, Foxp3, Il17的]mRNA表达与对照组相比无统计学差异。EAE实验组Mof, Foxp3,Il17的mRNA表达明显高于对照组,且与发病程度呈正相关。Tlr4, Tlr5, Tlr7, Tlr9 mRNA表达水平也高于对照组。5. SDS-PAGE;凝胶电泳分析发现无论是UC实验组还是EAE实验组组织中Mof,Foxp3蛋白表达量均高于对照组。6.Co-IP实验表明Mof与Foxp3在体内存在相互作用。7. ChIP-qPCR结果表明Mof可以结合到Foxp3, Tlr3, Tlr4, Tlr5, Tlr6, RoRrt基因启动子区。8.Mof过表达的HCT116细胞中,Tlr4蛋白和Foxp3蛋白表达量与对照组对比均明显增加。qRT-PCR结果同样证明了相似的结果。结论：1、本研究运用68周的C57BL/6小鼠作为材料,分别应用DSS葡聚糖硫酸钠(5000D)和MOG35-55多肽诱导结肠炎症和多发性硬化的发生,是一种建立溃疡性结肠炎模型和实验性变态性脑脊髓炎模型的简便可靠的方法。这两种模型可以用来研究人类炎性肠病的致炎机制及多发性硬化的发病机制。2、本研究发现,除遗传因素外,组蛋白乙酰转移酶Mo屿溃疡性结肠炎和多发性硬化症的发病有一定的关系,Mof通过与Foxp3相互作用从而调节炎症的发生与发展。3、Th17细胞分泌的炎性细胞因子1117可以促进多发性硬化的发展,但是在UC小鼠模型中却起到了双重作用。4、此外,研究还发现Tlr4及RoRrt也许在结肠炎和多发性硬化等自身免疫疾病发病机制中起到一定的作用,Mof可能参与调控这些基因的表达。
【图文】：

小鼠,基因表达,结肠,水平检测

Ｅ小樐结肠和脾脏纽织中ｍ民ＮＡ变化的检测逡逑ＥＡＥ小鼠中Ｍｏｆ，Ｆｏｘｐ３基因表达情况，与对照组相比有明显差异。逡逑ＮＡ表达水平均ｔｉＵＳｓｒＲＮＡ作为参照。在ＤＳＳ诱导３天的结肠组织中，Ｍｏｆ、逡逑达与野生型小鼠结肠姐织相比无明显差异。ＤＳＳ诱导７天后，Ｍｏｆ，Ｆｏｘｐ３逡逑高于对照纳。逡逑测巳ＡＥ小鼠中Ｔｌｒｓ基因表达情况显示，Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ邋４、Ｔｌｒ邋５、Ｔｌｒ邋７、Ｔｌｒ邋９邋ｍＲＮＡ逡逑量增加，其中Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ｔｌｒ７、Ｔｌｒ９变化最为显著。逡逑ＤＳＳ小鼠中Ｔｌｒｓ基因表达情况，结果最示在Ｄ巧诱导７天的结肠组织中，逡逑９的变化与对照组有统计学差异。然而在ＤＳＳ诱导３天的结肠组织中与对照逡逑；＊＊b6＜０．０１邋ＶＳ对照组；＊＊＊尸＜０．００１邋ＶＳ对照组；ｎｓ无统计学差异。逡逑ｆ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＤＳＳ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｍｉｃｅ邋ａｎｄ邋ＥＡＥ邋ｍｉｃｅ逡逑ｎ邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｍｏｆ邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉｎ邋ＥＡＥ邋ｍｉｃｅ邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ逡逑ｃｏｎ化ｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑ｌｓ邋ｗｅｉ＊ｅ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋ｔｏ邋化ｏｓｅ邋ｏｆ邋１８ｓｒＲＮＡ．Ｄｕｒｉｎｇ邋化ｅ邋ＤＳＳ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋３邋ｄａｙｓ，化ｅ逡逑ａｎｄ邋１Ｌ１７邋ｗｅｒｅ邋ｓｉｍｉｌａｒ邋ｗｉｔｈ邋ｗｉｌｄ邋ｔｙｐｅ邋ａｎｄ邋ｍｉｃｅ．邋Ａｆｔｅｒ邋ＤＳＳ邋ｉｎｄｕｃｅｄ邋７邋ｄａｙｓ，邋ｔｈｅ逡逑１７邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｗｅｒｅ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ邋４、Ｔｌｒ邋５、Ｔｌｒ邋７邋ａｎｄ邋Ｔｌｒ邋９邋ｉ

变化情况图,过表达,基因转录,细胞

（Ｂ）逡逑Ｔ１］６细胞过表达Ｍｏ垢检测各基因的蛋白表达与基因转录变化情况。逡逑ｌｒ４及Ｆｏｘｐ３蛋白在Ｍｏｆ过表达的ＨＣＴ１１６细胞情况进巧检测，发现Ｔｌｒ４及Ｆｏｘｐ３表达量逡逑加。逡逑ｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ９、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ１７基因在Ｍｏｆ过表达的ＨＣＴ１１６细胞情况进行检测，１８ｓｒＲＮＡ逡逑，，发现Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｆｏｘｐ３、ＩＬ１７基因ｍＲＮＡ水平显著增加。逡逑．Ｏｌｖｓ对照组；＊＊＊尸＜０．００１邋ＶＳ对照组；ｎｓ无统计学差异。逡逑ｒｏｔｅｉｎ邋ｅｘｐｒｅ巧ｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｇｅｎｅ邋ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｏｖｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓ邋Ｍｏｆ邋ｉｎ邋ＨＣＴＨ邋６邋ｃｅｌｌｓ．逡逑ｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｔｌｒ４邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉ打化ｅ邋ＨＣＴｌ邋１６邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｈａｔ邋ｏｖｅｒ逡逑ｅｄ邋Ｍｏｆ．邋Ｗｅ邋ｆｏｕｎｄ邋ｔｈａｔ邋ＴＩｒ４邋ａｎｄ邋Ｆｏｘｐ３邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｔｈａｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑ｍ民ＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋化化ｏｓｅ邋ｏｆ邋１８ｓｒＲＮＡ．邋Ａｆｔｅｒ邋ｏｖｅｒ邋ｅｘｐｒｅｓｓ邋Ｍｏｆ邋ｉｎ邋ＨＣＴｌ邋１６逡逑ｅ邋Ｔｌｒ３、Ｔｌｒ４、Ｆｏｘｐ３邋ａｎｄ邋ＩＬ１７邋ｍＲＮＡ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｈｉｇｈｅｒ邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｈｈ邋化ｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑．０１邋ｖｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋＊＊＊Ｐ＜０．００１邋ｖｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋ｎｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｎｏ邋ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ逡逑ｃｅｓ．逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574

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