粪菌移植对无菌小鼠胃肠运动的促进作用及机制研究

发布时间：2019-09-24 06:21

【摘要】：目的:肠道微生物种类繁多,数目庞大,其中细菌总量可占微生物总数的99%以上。这些在肠道内定植、复杂多样的细菌就被称之为肠道菌群。肠道菌群目前被认为是人类后天获得的一种重要器官。肠道菌群在宿主生理学中可起多重关键作用,包括辅助宿主消化吸收、调节能量吸收与代谢、参与机体免疫系统活化等。已知肠道菌群可促进宿主胃肠道运动,可能通过与胃肠组织中的免疫和神经内分泌系统相互作用而发挥关键作用,但其作用途径与机制尚不明确。5-羟色胺(5-HT)不仅作为神经递质而且在胃肠组织中作为免疫系统的介质,在调节胃肠道免疫系统和胃肠运动中可能起着关键作用。胰高血糖素样肽1(GLP-1)是由肠内分泌细胞产生的肠降血糖素激素,其生理学功能必须通过相应GLP-1受体的介导才能产生作用,不仅调节葡萄糖体内平衡,而且调节胃肠蠕动。因此本研究拟以无菌小鼠为研究对象,探讨肠道菌群如何影响胃肠蠕动,运用粪菌移植建立肠道运动改变的小鼠模型从5-HT表达和巨噬细胞行为之间的关联及GLP-1/GLP-1受体表达水平探索肠道菌群影响胃肠运动的机制。第一部分粪菌移植对无菌小鼠胃肠运动的影响方法:我们将6周龄的ICR野生型小鼠和6周龄ICR无菌小鼠分为两组:野生型组给予正常饮食饮水;粪菌移植组于无菌小鼠到达当时即刻以灌胃的方式给予SPF级别ICR野生型小鼠新鲜大便制成的粪菌悬液,给予正常饮食饮水,在无特殊致病原SPF级别条件饲养。实验0周、1周、2周、4周时记录两组小鼠体重变化,应用胭脂红红色溶剂灌胃后记录全胃肠道通过时间。另取10周龄ICR无菌小鼠作为无菌小鼠粪菌移植四周后的年龄对照组。肉眼记录小肠长度、结肠长度。HE染色观察胃、小肠、结肠大体形态变化。粪菌移植4周后检测胃排空量及肠道免疫相关分子水平变化。结果:(1)实验4周后粪菌移植组小鼠胃、小肠、结肠粘膜厚度均较6周龄及同周龄无菌小鼠有明显增厚,与野生组小鼠无统计学差异。(2)粪菌移植组小鼠小肠及大肠的长度较6周龄无菌小鼠及同周龄年龄无菌小鼠有增长趋势,与野生组小鼠无统计学差异。(3)无菌小鼠全胃肠道通过时间长于野生组小鼠;粪菌移植组全胃肠道通过时间短于6周龄及同周龄无菌小鼠。粪菌移植组小鼠全胃肠道通过时间较同周龄野生组小鼠无明显差异。(4)无菌小鼠胃排空率低于野生型小鼠;粪菌移植组胃排空率高于同周龄无菌小鼠,较野生组小鼠无差异。(5)粪菌移植可促进小鼠免疫系统成熟,增加CD4+T细胞比例,IL22因子及Reg蛋白表达水平升高。第二部分肠道菌群通过5-HT/巨噬细胞途径调控胃肠动力方法:我们收集上述对照组及粪菌移植组4周后实验动物组织。免疫组织化学染色检测5-HT阳性肠上皮细胞含量变化,巨噬细胞表型变化,巨噬细胞活化情况。Realtime PCR检测5-HT限速酶TPH m RNA水平变化,进一步分析5-HT、巨噬细胞表型与胃肠道通过时间三者间的相关性及可能机制探讨。结果:(1)粪菌移植组及无菌组小鼠胃、小肠、结肠粘膜上皮可见5-HT免疫阳性细胞及M2型巨噬细胞;胃、小肠、结肠肌层神经团周围可见M2型巨噬细胞。(2)粪菌移植可明显增加胃肠道肌层M2型巨噬细胞,而M1型巨噬细胞无明显变化。(3)粪菌移植可明显增加胃肠道粘膜层5-HT免疫阳性细胞。(4)粪菌移植可促进无菌小鼠胃肠运动。(5)全胃肠道通过时间与胃肠道粘膜层5-HT免疫阳性细胞及胃肠道肌层M2型巨噬细胞呈负性相关。(6)在全胃肠道上皮组织粘膜层和肌层中5-HT免疫阳性细胞数量与M2型巨噬细胞呈正性相关。第三部分肠道菌群可通过影响GLP-1/GLP-1r途径调控胃肠动力方法:我们将6周龄的ICR野生型小鼠和6周龄ICR无菌小鼠分为两组:野生型组及粪菌移植组。实验0周、4周时两组分别尾静脉注射GLP-1类似物Exendin4,胭脂红红色溶剂灌胃后记录全胃肠道通过时间。收集粪菌移植4周后两组实验动物组织。免疫组织化学染色检测GLP-1及GLP-1受体阳性细胞含量变化,肠道神经细胞水平变化。Realtime PCR检测粪菌移植对动物胃肠道组织及细菌上清液对神经细胞GLP-1r m RNA水平的影响,进一步分析GLP-1、GLP-1受体、肠道神经细胞与胃肠道通过时间几者间的相关性及可能机制探讨。结果:(1)粪菌移植组及无菌组小鼠小肠、结肠粘膜内分泌细胞可见GLP-1表达;胃、小肠、结肠组织肌间神经细胞中可见GLP-1受体表达。(2)粪菌移植组胃肠道GLP-1的表达上升,与机体发育相关。(3)粪菌移植可明显减少胃肠道肌间神经细胞GLP-1受体阳性细胞。(4)无菌组小鼠胃肠运动明显低于粪菌移植组。粪菌移植可促进无菌小鼠胃肠运动。(5)全胃肠道通过时间与胃肠道GLP-1受体阳性细胞呈正性相关。(6)给予上述两组小鼠GLP-1受体激动剂后,无菌小鼠全胃肠道通过时间明显延长。结论:粪菌移植可促进无菌小鼠胃肠运动,通过与胃肠组织中的免疫和神经内分泌系统相互作用而发挥关键作用。粪菌移植可(1)上调5-HT表达,使巨噬细胞向M2型极化,进而启动巨噬细胞-神经细胞通路,(2)改变肠道肌间神经细胞GLP-1/GLP-1受体表达水平,促进胃肠动力。
【图文】：

图 1.1 实验设计示意图（FMT：粪菌移植；GF：无菌小鼠；SPF：无特殊致病菌；GI transittime：胃肠道通过时间；Tissue：留取组织标本；Gastric emptying：胃排空率；w：周）1.2.2.2 制备粪菌移植菌液（1）选取健康适龄野生型 ICR 小鼠作为供体；（2）收取新鲜排出的小鼠粪便，电子天平立即对新鲜粪便进行称重；（3）按照参考文献所示，使用生理盐水将粪便 10 倍稀释于其中，细致研磨后过滤粪便残渣；（4）将所得新鲜粪菌液混合，冰上转运，用于 FMT。1.2.2.3 粪菌移植方法将每只小鼠分别转移到单独的笼中，用灌胃针吸取过滤后新鲜菌液，以灌胃的方式打入小鼠胃内，每只小鼠灌入 0.3mL 新鲜菌液，灌胃后观察 30 分钟，，实验小鼠未出现任何异常后合笼饲养。1.2.2.4 标本留取方法（1）FMT 组小鼠根据实验处理后收集数据不同分为胃肠道通过时间和组织

天津医科大学博士学位论文 一、粪菌移植促进无菌小鼠胃肠动力在一共 28 天的实验周期内，各组小鼠耐受情况均可，除粪菌移植组 ICR 小鼠在粪菌移植时出现短暂呛咳、呼吸受阻外，其余未均未出现便血、腹泻、便秘及死亡现象。各组小鼠体重随着时间逐渐增长，粪菌移植组与野生组 ICR 小鼠体重增长相比较均无统计学差异（见图 1.2）
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R57

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本文编号：2540720