不同阻断方式对肝脏缺血再灌注损伤的影响及塞来昔布保护作用的实验研究

发布时间：2020-03-22 18:38

【摘要】：肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic ischemiareperfusion injury，I/R）是指肝脏组织缺血一段时间后恢复血液灌注，不但不能使其原有功能和结构得以恢复，反而更为加重其功能障碍和结构损伤的现象。肝脏缺血再灌注损伤在肝脏外科疾病中是最为常见的一种病理过程，常见于肝脏移植、肝脏肿瘤切除术、肝外伤及失血性休克等，可引起严重的肝脏及其他器官功能的衰竭，也是手术失败和导致患者死亡的重要原因之一。因此探讨肝脏缺血再灌注损伤的发生发展过程及对其产生保护作用的相关因素及分子机理，揭示其发生发展及保护作用的精确分子机制、寻找能够预防和治疗肝脏缺血再灌注损伤的新型药物，对进一步提高我国肝脏疾病的治疗水平具有重要意义。手术治疗是目前治疗原发性和继发性肝肿瘤的最佳手段，由于肝脏复杂的血管分布和丰富的血流供应，使得肝脏手术中极难控制出血。越来越多临床实践证实，术中大量输血可能导致术后病死率、并发症发生率增高及肝癌患者长期生存率降低。所以，术中阻断肝脏供血对于减少术中出血有着很重要的作用。目前术中阻断入肝血流的方法最常用的是肝蒂阻断法(Pringle法)，可有效的控制术中发生的出血，但同时肝组织缺血再灌注损伤的发生率较高，甚至导致术后肝功能衰竭等严重并发症。如何根据病情合理的选择肝血供的阻断方式对于患者术后肝功能恢复有着很重要的影响。因此，选择性入肝血流阻断，包括半肝阻断、区域阻断以及单纯门静脉阻断等方法不仅有效减少术中出血，而且非常有助于术后肝功能的恢复。环氧化酶(Cyclooxygenase，，COX)是催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）合成前列腺素（Prostaglandin，PG）和血栓素（Thromboxane，TX）的关键限速酶。COX通常以两种亚型存在于组织中。COX-1为结构型，存在于大多数组织中，催化生成维持正常生理功能所需要的前列腺素；COX-2为诱导型，在正常情况下大多数的组织中表达极低，但是在炎症、肿瘤、缺血再灌注等过程中表达明显增加。有研究表明，COX-2参与了缺血后脑损伤的发生、发展，并与脑缺血的预后关系密切。塞来昔布（Celecoxib）是一种选择性的COX-2抑制剂，化学名为4-[5-（甲苯基）-3-（三氟甲基）-1-H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，它能抑制COX-2的高表达，从而抑制花生四烯酸的代谢产物PGI2与TXA2的比例（TXA2/PGI2）水平失衡，减轻炎症反应，改善微循环，减轻组织损伤和细胞水肿，从而减少肝脏I/R的程度。临床上主要用于骨关节炎、类风湿性关节炎的治疗，在脑缺血再灌注的研究表明其可能通过降低脑组织中TXA2/PGI2的比值，减轻炎症反应，改善微循环，减轻脑损伤和脑水肿，且可减少氧自由基的产生，提高SOD活性从而发挥脑保护作用。目前关于COX-2对缺血再灌注的直接作用研究主要还是集中在COX-2对脑缺血再灌注损伤等领域，而关于COX-2对肝脏缺血再灌注损伤的研究还比较少，许多问题还未得到彻底阐明。本实验在建立的大鼠肝脏的缺血再灌注模型中加用不同剂量塞来昔布来抑制COX-2的活性，通过测定各组大鼠缺血灌注后肝脏中COX-2、p-Stat3（pTry705）等的表达水平，进一步探讨塞来昔布在肝脏缺血再灌注损伤中的作用及其详细机制。目的：1.观察不同阻断方式对肝脏I/R的影响。2.观察塞来昔布对大鼠肝脏I/R的影响及作用机制。方法：1.选用健康雄性SD大鼠60只，随机分为2组(n=30)，分别为：单纯门静脉阻断组（A组）：充分暴露肝门部，仔细分离左、中肝的肝蒂，小心剥离其表面的Glisson鞘和胆管，分离门静脉与肝动脉，用无损伤动脉夹夹闭左、中门静脉分支，同时保留左、中肝动脉及右肝血供。肝蒂阻断组（B组）：充分暴露肝门部，分离肝左、中叶的门静脉、肝动脉及胆管，用无损伤动脉夹夹闭整个左、中肝肝蒂。两组均夹闭60min，恢复血流后于1、3、6、12、24h取血液标本检测ALT、AST的浓度；取肝脏组织标本检测MDA、MPO的浓度。2.选用健康雄性SD大鼠30只，随机分为5组(n=6)，分别为：Ⅰ组（对照组）：开腹阻断门静脉和肝动脉后给予生理盐水灌胃；Ⅱ组（假手术组）：开腹未阻断门静脉和肝动脉，关腹；Ⅲ组（低剂量塞来昔布组）：开腹阻断门静脉和肝动脉后给予塞来昔布10mg/kg灌胃；Ⅳ组（中剂量塞来昔布组）：开腹阻断门静脉和肝动脉后给予塞来昔布20mg/kg灌胃；Ⅴ组（高剂量塞来昔布组）：开腹阻断门静脉和肝动脉后给予塞来昔布40mg/kg灌胃。各组均夹闭肝蒂30min后开放6小时，取血液标本检测ALT、AST的浓度，以确定肝脏缺血再灌注后损伤高峰时相和塞来昔布的保护作用；取肝脏组织标本检测MDA、MPO的浓度；通过HE染色方法观察肝脏损伤的情况；Western blot方法检测COX-2、STAT3及p-Stat3（pTry705）在肝脏组织中的表达水平。结果：1.通过监测大鼠体内ALT、AST、MDA及MPO的浓度，我们发现，与肝蒂阻断组比较，单纯门静脉阻断组血液内ALT和AST的浓度均明显下降（P0.05），同时，单纯门静脉阻断组血液内MDA和MPO的浓度均明显低于肝蒂阻断组（P0.05）。2.通过监测大鼠体内ALT、AST、MDA及MPO的浓度，我们发现，与假手术组比较，对照组血液内ALT和AST的浓度均明显升高（P0.05），与对照组比较，不同浓度的塞来昔布组的ALT和AST的浓度均有所下降，其中以中剂量塞来昔布组最为明显（P0.05）；同时，与假手术组比较，对照组血液内MDA和MPO的浓度均明显升高（P0.05），与对照组比较，不同浓度的塞来昔布组的MDA和MPO的浓度均有所下降（P0.05），其中以中剂量塞来昔布组最为明显，提示再灌注后6小时肝脏损伤明显，而塞来昔布可逆转肝脏的缺血再灌注损伤。HE染色发现假手术组仅见少量细胞水肿，肝小叶结构基本正常；而对照组肝血窦充血、扩张明显，肝脏细胞水肿明显，细胞核深染，可见少量片状坏死；塞来昔布处理组见部分肝细胞水肿，核深染，可见点状细胞坏死，汇管区轻度扩张，偶有少量充血，其中，中剂量组肝脏细胞损伤程度较低。Westernblot法检测COX-2、STAT3及p-Stat3（pTry705）的表达水平发现，与假手术组比较，对照组COX-2及p-Stat3（pTry705）的表达水平均明显升高（P0.05），与对照组比较，不同浓度的塞来昔布组COX-2及p-Stat3（pTry705）的表达水平均下降，其中以中剂量塞来昔布组最为明显（P0.05）；STAT3在各实验组中的表达水平并无明显变化，提示塞来昔布对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用与COX-2及p-Stat3相关。结论： 1.区域阻断血供切肝术是一种安全的手术方式，可以有效的减少患者术中肝脏的损伤以及利于术后肝功能的恢复。 2.单纯门静脉阻断的大鼠肝脏缺血再灌注损伤比肝蒂阻断的大鼠较轻，其机理可能与再灌注后脂质过氧化反应和中性粒细胞浸润有关。 3.塞来昔布可降低ALT、AST及MDA、MPO的表达水平从而对肝脏缺血再灌注损伤起到保护作用，并且以中等剂量（20mg/kg）效果较好。 4.塞来昔布对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用可能与COX-2、 p-Stat3（pTry705）的表达下降相关。
【图文】：

再灌注,三次,数据,研究结果

结果LT、AST 检测结果我们的研究结果发现，未处理大鼠血清中 ALT 含量为 37.83±4.31，AST 含量为 96.33±22.66。单纯门静脉阻断 30 min 再灌注 1、3、6、12、24 h 大鼠血清中 ALT含量分别为 298.83±54.06 、 476.83±47.27 、 664.00±125.73 、 902.00±166.78 、88.17±19.53 ， AST 含量分别为 425.00±21.75 、 776.17±84.42、 974.83±103.38 、1250.00±237.67、456.17±87.59。肝蒂阻断 30 min 再灌注 1、3、6、12、24 h 大鼠血清中 ALT 含量分别为 474.50±59.30 、 856.33±43.67 、 1147.17±209.12 、1948.33±181.25、291.83±59.32，AST 含量分别为 959.83±118.05、1291.00±193.63、2092.83±398.09、2961.50±295.93、768.00±107.99。不同时间点单纯门静脉阻断组的 ALT、AST 含量均低于肝蒂阻断组（p＜0.05）。（结果见图 1, 2）。

检测结果,三次,数据,再灌注

图 2 各组大鼠血清 AST 检测结果，数据来自三次独立的实验。2. 肝组织 MDA 检测结果各组大鼠经不同处理后，取肝脏组织进行 MDA 检测，结果发现，未处理大鼠肝组织中 MDA 含量为 1.228±0.091。单纯门静脉阻断 60min 再灌注 1、3、6、12、24h 大鼠肝脏组织中的 MDA 含量分别为 1.416±0.127、1.797±0.088、2.271±0.103、2.919±0.075、1.559±0.081。肝蒂阻断 60min 再灌注 1、3、6、12、24h 大鼠肝脏组织中的 MDA 含量分别为 1.722±0.137、2.167±0.136、2.840±0.117、3.674±0.091、1.759±0.127。不同时间点单纯门静脉阻断组大鼠肝脏组织中的 MDA 含量均低于肝蒂阻断组（p＜0.05）。（结果见图 3）。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575

【参考文献】