柳氮磺胺吡啶对肝星状细胞株HSC-T6增殖和凋亡的作用及机制研究

发布时间：2020-03-25 09:10

【摘要】： 研究背景: 肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)凋亡是肝纤维化逆转的重要机制,而肝细胞凋亡是肝纤维化形成的重要促进因素,因此寻找选择性诱导HSCs凋亡的治疗途径对于抗肝纤维化具有非常重要的意义。柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine,SASP)从20世纪40年代由5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)和磺胺吡啶(sulfapyridine,SPY)通过偶氮键合成了SASP,主要用于治疗溃疡性结肠炎和克隆病。已有研究表明,柳氮磺胺吡啶可选择性诱导多种类型细胞的凋亡,其机制尚不清楚。它对肝星状细胞和正常肝细胞的凋亡有无影响报道甚少。我们以柳氮磺胺吡啶为诱导剂,观察柳氮磺胺吡啶及其分解产物5-氨基水杨酸和磺胺吡啶在体外对正常人肝细胞株(L02细胞)和大鼠肝星形细胞株(HSC-T6细胞)增殖和凋亡的影响,确定其有效的药物成分,并探讨其可能的机制。方法: 1、最佳药物浓度与作用时间的筛选: 实验分组:柳氮磺胺吡啶作用浓度:0.125、0.25、0.5、1、 2、4、8、16mmol/L;作用时间:12、24和48小时。实验方法:CCK-8法检测不同浓度的柳氮磺胺吡啶在不同时间点对HSC-T6增殖的影响。 2、柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02增殖和凋亡的影响实验分组:正常对照组;0.1% DMSO对照组;柳氮磺胺吡啶处理组(0.5、1、2 mmol/L)。实验方法:CCK-8法检测柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02增殖的影响;ANNEXINⅤ-FITC/PI双染观察柳氮磺胺吡啶对HSC-T6和L02凋亡的影响;AO/EB染色观察细胞凋亡形态。 3、诱导HSC-T6凋亡的有效药物成分分析实验分组:正常对照组;0.1%DMSO对照组;柳氮磺胺吡啶处理组(0.5、1、2mmol/L);5-氨基水杨酸处理组(0.5、1、2mmol/L);磺胺吡啶处理组(0.5、1、2mmol/L);5-氨基水杨酸(2mmol/L)+磺胺吡啶(2mmol/L)处理组。实验方法:采用CCK-8法检测各实验组HSC-T6增殖情况;ANNEXINⅤFITC/PI双染检测各实验组HSC-T6凋亡情况。 4、柳氮磺胺吡啶选择性诱导HSC-T6凋亡的机制 4.1、柳氮磺胺吡啶及其分解产物对IKKα和IκBα磷酸化的影响实验分组:正常对照组;TNF-α处理组(150U/ml);DMSO+TNF-α处理组;TNF-α+柳氮磺胺吡啶处理组(0.5、1、2mmol/L);TNF-α+5-氨基水杨酸处理组(2mmol/L);TNF-α+磺胺吡啶处理组(2mmol/L)。实验方法:Western Blot检测磷酸化IKKα和磷酸化IκBα的表达。 4.2、柳氮磺胺吡啶及其分解产物对NF-?B核转位的影响实验分组:正常对照组;TNF-α处理组(150U/ml);DMSO+TNF-α处理组;TNF-α+柳氮磺胺吡啶处理组(2mmol/L);TNF-α+5-氨基水杨酸处理组(2mmol/L);TNF-α+磺胺吡啶处理组(2mmol/L)。实验方法:采用NF-?B分子标记和激光共聚焦显微镜观察NF-?B核转位抑制情况;Western Blot检测细胞核NF-?B P65的表达。结果: 1、与对照组比较,在一定浓度范围(0.5、1、2、4、8、16mmol/L)内,柳氮磺胺吡啶对HSC的增殖呈剂量、时间依赖性抑制。柳氮磺胺吡啶在12、24、48小时抑制HSC-T6细胞增殖的50%抑制浓度(IC50)分别为6.53、2.84、1.5mmol/L。结合文献,我们取接近24h的1/3～2/3的IC50浓度(0.5、1、2mmol/L)进行后继实验。 2、正常对照组和DMSO对照组的凋亡率分别为1.74±0.31%,3.42±0.41%;柳氮磺胺吡啶(0.5、1、2mmol/L)处理24小时后HSC-T6的凋亡率依次为6.96±0.39%、12.09±1.56%和16.72±2.98%,呈明显的时间和剂量效应,同时伴有晚期凋亡细胞增加。AO/EB染色后,出现凋亡细胞的特征性改变。 3、柳氮磺胺吡啶(0.5、1、2 mmol/L)处理L02 24小时后对L02的增殖抑制率和凋亡率与正常对照组和DMSO对照组之间无统计学差异(P0.05);AO/EB染色后,未观察到凋亡细胞。 4、5-氨基水杨酸和磺胺吡啶(0.5、1、2 mmol/L)处理HSC-T6 24小时后,HSC-T6的增殖抑制率和凋亡率与正常对照组和DMSO对照组之间无统计学差异(P0.05)。 5、柳氮磺胺吡啶处理组(0.5、1、2mmol/L)磷酸化IKKα、I?Bα较DMSO+TNF-α处理组逐渐减弱;而5-氨基水杨酸(2mmol/L)和磺胺吡啶(2mmol/L)处理组磷酸化IKKα、I?Bα与DMSO+TNF-α处理组之间无统计学差异(P0.05)。 6、柳氮磺胺吡啶处理组(2mmol/L)细胞核NF-?B P65的表达较TNF-α处理组明显减弱;而5-氨基水杨酸(2 mmol/L)和磺胺吡啶(2mmol/L)处理组细胞核NF-?B P65的表达与TNF-α处理组之间无统计学差异(P0.05)。 7、正常对照组NF-κB P65主要在细胞浆表达,少量在胞核表达,TNF-α处理组NF-κB P65几乎都在细胞核表达,柳氮磺胺吡啶组NF-κB P65细胞核几乎不表达;柳氮磺胺吡啶+TNF-α处理组较TNF-α处理组NF-κB P65细胞核表达明显减弱。结论: 1、柳氮磺胺吡啶能够选择性抑制肝星状细胞增殖并诱导其凋亡;其分解产物5-氨基水杨酸和磺胺吡啶对肝星状细胞增殖和凋亡无明显影响。 2、柳氮磺胺吡啶诱导HSC-T6凋亡的同时伴有磷酸化IKKα、磷酸化IκBα蛋白以及胞核内NF-κB P65蛋白表达的减少,提示柳氮磺胺吡啶可能通过抑制Rel/NF-?B/I?B/IKK信号通路诱导HSCs凋亡。
【图文】：

附图,对照组,处理组

附图 1-ⅠA 正常对照组 12 hFigure 1-ⅠA normal control group 12h附图 1-ⅠB DMSO 对照组 12 hFigure 1-ⅠB DMSO treated group 12 h附图 1-ⅠC 0.5mmol/L SASP 处理组 12 hFigure 1- Ⅰ C 0.5mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附图 1-ⅠD 1mmol/L SASP 处理组 12 hFigure 1- Ⅰ D 1mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h

处理组,附图,流式细胞仪检测

附图 1-ⅠC 0.5mmol/L SASP 处理组 12 hFigure 1- Ⅰ C 0.5mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附图 1-ⅠD 1mmol/L SASP 处理组 12 hFigure 1- Ⅰ D 1mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附图 1-ⅠE 2mmol/L SASP 处理组 12 hFigure 1-ⅠE 2mmol/L sulfasalazinetreated group 12 h附图 1-Ⅰ Annexin V-FITC 流式细胞仪检测 SASP 对 HSC-T6 凋亡的影响(12 小时)Figure 1-ⅠApoptotic rate of HSC-T6 which were treated with sulfasalazine for 12 hoursby FCM with Annexin V-FITC
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R575.2

【参考文献】