胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMC转运中作用的体外实验研究

发布时间：2020-03-25 09:41

【摘要】：目的 ①在体外建立共培养模型模拟胎盘屏障的跨细胞转运。②胎盘细胞凋亡在感染HBV的PBMCs转运中作用。 方法 ①本次实验采用100μl HBV DNA含量为5×10~6copies/ml的病人血清感染PBMC,用CCK-8试剂盒检测不同共培养时间点12h、24h、48h和72h细胞的生长状况。将共培养的细胞清洗4次，用FQ-PCR法检测PBMC和洗液中的HBV DNA的含量。 ②在1μm孔径Transwell小室共培养模型中，用流式细胞技术（FACS）检测Transwell小室上室感染HBV的PBMC与BeWo的融合现象。以8μm孔径Transwell小室共培养模型中，用流式细胞技术（FACS）检测下室中是否出现标有绿色荧光的PBMC。 ③本次实验将共培养模型设立三个组：正常对照组、HBV与BeWo共培养组、HBV~+PBMC与BeWo共培养组，在共培养0h、12h、24h、48h后分别收集各组细胞通过FACS检测细胞的凋亡情况。 ④用RT-PCR法检测HBV~+PBMC与BeWo共培养组不同时间点0h、12h、24h、48h，BeWo细胞的Caspase3 mRNA的表达情况。 ⑤用FQ-PCR法检测HBV~+PBMC与BeWo共培养组下室中的PBMC的HBV DNA和HBVcccDNA含量。 结果 ①5×10~6copies/ml的HBV阳性血清刺激PBMC，共培养12h、24h和48hPBMC的细胞数不断增加，共培养72h左右，细胞数会减少。与HBV血清共培养48h的PBMC检测出HBVDNA，提示发生感染，而清洗细胞的洗液中未检测出HBV DNA。 ②在1μm孔径的Transwell小室共培养模型中BeWo细胞被染上了绿色荧光提示HBV~+PBMC与BeWo发生了融合。以8μm孔径的Transwell小室进行实验，下室中检测到标有绿色荧光的PBMC，证明在Transwell小室共培养感染HBV的PBMC与BeWo细胞模拟胎盘屏障的跨细胞转模型构建成功。 ③BeWo与HBV血清和HBV~+PBMC共培养0h、12h、24h、48h，HBV感染组和HBV~+PBMC共培养组的早期凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（F值分别为0.027、1.824、7.186、7.749，P值均大于0.05）。在共培养0h、12h，HBV感染组和HBV~+PBMC共培养组，BeWo总凋亡率与对照组比较差异无统计学意义（F值分别为2.922、1.356，P值均大于0.05）；但是共培养24h、48h，HBV感染组总凋亡率与同期的对照组和HBV~+PBMC共培养组比较差异有统计学意义（F值分别为15.678、14.892，P值均小于0.05）。分别对同一组内不同时间点的早期凋亡率及总凋亡率进行比较，各组中不同时间点的凋亡率不同，随着共培养时间的延长，凋亡率呈现增加的趋势，到48h时HBV感染组总凋亡率为（68.90±0.33）%达到最高。不同时间点早期凋亡率的比较，除了对照组其它各组的差异均有统计学意义（F值分别为3.968、31.648、31.941，对照组P值大于0.05，其他各组P值均小于0.05），且不同时间点总凋亡率的差异有统计学意义（F值分别为82.827、29.292、63.951，P值均小于0.05）。 ④HBV~+PBMC与BeWo共培养组不同的时间点BeWo细胞Caspase3 mRNA的表达量相比较差别有统计学意义（F=38.114,P=0.002），且各组间两两比较后，除12h与0h外，Caspase3mRNA的相对表达量相比无差异外，其他各组间差异均有统计学意义。在24h和48h组中，随着时间的延长Caspase3 mRNA的相对表达量有升高的趋势。 ⑤在BeWo细胞和HBV~+PBMC共培养组中，BeWo细胞早期凋亡率与PBMC迁移率呈正相关关系(r=0.908，p=0.002)，BeWo细胞总凋亡率与PBMC迁移率呈正相关关系(r=0.969，p=0.001)。BeWo细胞Caspase3 mRNA相对表达量和PBMC迁移率呈正相关关系（r=0.950，p=0.001）。 ⑥HBV~+PBMC与BeWo细胞共培养24h和48h时，下室的PBMC HBV DNA拷贝数分别为(1.925±0.431)×10~3copies/ml、(2.565±0.361)×10~3copies/ml，，同时，在此时间点HBV cccDNA的拷贝数分别为(7.560±1.513)×10~2copies/ml、(1.3550±2.473)×10~3copies/ml，按判断标准HBV DNA拷贝数≥103copies/ml为阳性，提示此时间点下室中的PBMC发生感染，且按判断标准HBV cccDNA拷贝数≥5×10~2copies/ml为阳性，提示HBV发生复制。 结论 ①乙型肝炎病毒能够在PBMC中复制，并在体外成功构建BeWo细胞与感染HBV的PBMC共培养模型模拟胎盘屏障的跨细胞转运。 ②胎盘细胞凋亡率与PBMC的迁移率的正相关关系，提示凋亡可能与感染HBV的PBMC的转运有关。 ③上室中感染HBV的PBMC转运至下室后，可感染下室的PBMC。可推论若感染HBV的母亲PBMC转运至胎儿血循环会造成胎儿PBMC HBV感染。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】

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8 白菡;张琳;何丽霞;冯国和;石理兰;窦晓光;赵桂珍;;胎盘滋养层细胞的感染和凋亡与HBV的宫内传播机制[J];世界华人消化杂志;2007年15期

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本文编号：2599737