Huh7.5.1细胞感染HCV并干扰素治疗过程中miRNA表达谱的变化的研究

发布时间：2017-03-21 21:10

  本文关键词：Huh7.5.1细胞感染HCV并干扰素治疗过程中miRNA表达谱的变化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：丙型病毒性肝炎是以肝脏为主要靶器官,由丙型肝炎病毒(HCV)所致的感染性疾病。据世界卫生组织统计,全球感染丙型肝炎病毒的患者约达1.7亿人,肝硬化和HCV相关的肝细胞癌(HCC)是丙型肝炎患者的主要死因,对世界人民的生命安全造成了极大的威胁,因此积极寻找有效治疗HCV的办法显得至关重要。 近10年来,丙型病毒性肝炎的治疗取得了较大的进展,干扰素在其治疗过程中发挥了越来越重要的作用。从最初的单用α-干扰素(IFNa)台疗发展为IFNα与利巴韦林联合治疗；到近几年来提倡采用聚乙二醇化-IFNa(Pegylated Interferona, PEG-IFNa)口上利巴韦林治疗,使得持久病毒应答率有了很大的提高。然而,在不同的人中α-干扰素的治疗效果差异很大。目前α-干扰素功能的实现和信号通路的研究已经相当深入,已有研究证实JAK/STAT级联信号传导是α-干扰素体现其活性的主要方式,该信号传导通路受到多重机制的严密调控,其中,抑制性的信号分子,如SOCS家族,能负向调控α-干扰素信号传导。最终,a-干扰素的信号传导改变了细胞内数百种基因的表达,通过这些调控的基因,α-干扰素实现了对细胞功能的调控。但是对于α-干扰素对不同人群治疗效果的差异性,尚未有研究对其机制进行明确的阐述。 基因沉默是真核生物细胞基因表达调节的一种重要手段。基因沉默一般发生在两种水平上,一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起转录水平上的基因沉默(tran-scriptional gene silencing,TGS),另一种是转录后基因沉默(post-transcriptional gene silen-cing,PTGS),即在基因转录后的水平上通过对目标RNA进行特异性降解而导致基因失活。这是为了保护自身,动植物在长期进化过程中形成的一种限制外源核酸入侵的防卫保护机制。 MicroRNA(MiRNA)是细胞内一类表达丰富、非编码的高度保守的小RNA,长度为18-25nt。MiRNA表现出一种转录后调控基因表达的全新机制,它通过结合靶基因的mRNA的3’UTR抑制基因的表达。MiRNA已经被证实在发育、感染、免疫应答、炎症反应和肿瘤的发生等多种生理与病理过程中发挥作用。从最初发现到现在,已经在哺乳动物中发现了700多个MiRNA,其中绝大部分MiRNA的生物学功能是未知的。已有报道,MiRNA参与免疫应答中多方面的调控作用。但目前为止尚未见报道MiRNA能够调控干扰素的信号通路进而影响抗病毒天然免疫,也没有报道MiRNA参与到干扰素对免疫细胞功能的调控作用。 正是基于上述研究背景,我们为了探寻可能对丙型肝炎病毒(HCV)转染,复制及清除有作用的MiRNA,我们首先通过对pFL-J6JFH-1质粒进行体外转录得到HCV RNA的转录体,然后在Huh7.5.1细胞培养达到60%～70%汇合度时,把HCV RNA转染进去。转染后第3天,提取感染细胞内的总RNA,并通过逆转录试剂盒对其进行扩增,与正常Huh7.5.1细胞作对比,以确定转染是否成功。然后用IFNa-2B处理上述感染细胞,48h后再次使用荧光定量PCR对细胞内RNA进行检测,并与未经任何处理的感染细胞作对比。最后采用MiRNA表达谱芯片技术对正常Huh7.5.1细胞,HCV感染后的Huh7.5.1细胞,以及感染后经干扰素治疗的Huh7.5.1细胞分别进行了MiRNA的表达的测定,并采用2(-ΔΔCT)法分析组间MiRNA的表达情况。 结果经过筛选我们发现与正常Huh7.5.1细胞中表达的MiRNA相比,有13种MiRNA在HCV感染后表达上调,而在干扰素治疗后则出现下调；另外还有7种MiRNA则在HCV感染后出现表达下调,而在干扰素治疗后则发生上调。其中MiRNA10a可能与病毒的复制及清除过程有关,MiRNA21可能与HCV病毒侵入导致宿主需要抑制它的转录有关,MiRNA149可能与抑制病毒的复制有关MiRNA152可能与自身免疫耐受相关,还有MiRNA99b, MiRNA200b, MiRNA210,MiRNA616,在HCV感染以及干扰素处理中发生明显变化,但未在病毒感染中见到报道,可能与一些新机制有关。 结论MiRNA10a、MiRNA21、MiRNA149、MiRNA152、MiRNA99b、 MiRNA200b、MiRNA210、MiRNA616等实验中发生明显变化的MiRNA均可能与HCV的复制、转录、清除过程有关,需要我们通过进一步的实验去揭示它们之间的关系。
【关键词】：丙肝病毒 MiRNA Huh7.5.1细胞 干扰素治疗
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 致谢4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 目次12-13
• 引言13-18
• 1、实验材料18-19
• 2. 实验方法19-23
• 3、实验结果23-32
• 4、讨论32-36
• 5. 结论36-37
• 参考文献37-40
• 综述40-50
• 参考文献46-50
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果50

【参考文献】

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本文编号：260302