体内外研究羟基胆固醇硫酸基转移酶（SULT2B1b）及其硫化产物对肝脏增生的影响及机制

发布时间：2020-03-31 08:47

【摘要】：前言胞浆硫酸基转移酶(SULT)2Blb能够催化胆固醇及羟基胆固醇的3β-羟基硫酸化,其催化25-羟化胆固醇(25HC)硫酸化反应的主要产物为3-硫酸-25-羟化胆固醇(25HC3S)。研究发现SULT2B1b能够抑制羟基胆固醇对肝X受体(LXRs)的激活,并且其硫酸化产物可以通过抑制LXR/SREBPs信号转导通路降低细胞内脂质水平。而LXRs信号途径的激活对细胞增殖起负调节作用。因此SULT2B1b及其硫化产物25HC3S可能对肝脏增生起重要作用。本实验中,我们在小鼠正常肝脏、原代大鼠肝脏细胞(PRH)以及小鼠肝脏部分切除术(PH)模型中研究SULT2B1b对肝脏增生的作用及机制,并在小鼠正常肝脏中检测SULT2B1b的硫化产物25HC3S对肝脏增生的影响及相关机制。第一部分体内外研究SULT2B1b对肝脏增生的影响第一节SULT2B1b对小鼠肝脏增生以及原代大鼠肝细胞(PRH)生长的影响及相关机制目的：探索SULT2B1b对小鼠肝脏以及PRH增生的影响及机制。方法：将含有SULT2B1b基因的腺病毒感染C57BL/6(?)、鼠及PRH后,运用PCNA免疫组织化学染色法检测肝脏增生状态；应用免疫荧光双染法定位肝脏内SULT2B1b与PCNA的表达；采用siRNA干扰技术反面验证SULT2B1b对肝细胞生长的影响；通过实时定量PCR和免疫印迹的方法检测基因表达水平。结果：体内实验表明小鼠肝脏组织中的PCNA阳性细胞率随SULT2B1b表达水平的升高而明显增加,并存在剂量和时间依赖性；肝脏内几乎所有存在PCNA表达的细胞核均伴随SULT2B1b在细胞质的高表达,而没有SULT2B1b表达的细胞内也检测不到PCNA的表达。在SULT2B1b相对高表达的PRH内,采用RNA干扰技术抑制SULT2B1b基因的表达,引起细胞周期调节基因CDK2, FoxM1b,与Cyclin A的表达明显降低。此外,LXR人工合成激动剂T0901317可有效阻断体内夕(?) SULT2B1b所诱导的PCNA棩表达升高。结论：SULT2B1b能够通过抑制LXR信号转导通路的活性促进体内外肝细胞增生。第二节在部分肝切除术(PH)后的小鼠模型中研究SULT2B1b对肝脏再生的影响及机制目的：研究SULT2B1b对肝脏再生的影响及机制。方法：在C57BL/6小鼠体内建立肝脏PH再生模型,并通过尾静脉注射含有SULT2B1b基因的腺病毒或对照病毒；病毒感染5天后,应用免疫组织化学的方法分析肝再生过程中的PCNA阳性细胞率；采用HPLC技术检测肝脏内羟基胆固醇的变化；运用实时定量PCR和免疫印迹法检测基因表达水平。结果：SULT2B1b过表达的小鼠肝脏恢复较快,约于术后三天恢复到肝脏原始大小的80%,而对照组需要将近5天达到同样水平。SULT2B1b过表达增加了肝脏再生过程中的PCNA阳性细胞率以及增生相关基因的表达水平；降低了肝脏内的羟基胆固醇含量以及LXR信号转导通路下游基因SREBP-1和ABCA1的表达水平。结论：SULT2B1b能够通过抑制羟基胆固醇/LXR信号转导通路促进肝脏损伤后的再生。第二部分在小鼠体内研究羟基胆固醇硫化物对肝脏增生的影响及其相关机制目的：探索SULT2B1b的硫化产物(25HC3S)对小鼠体内肝脏增生的影响及机制方法：向C57BL/6小鼠尾静脉直接注射3-硫酸-25-羟化胆固醇(25HC3S)化合物,或向感染了腺病毒(Ad-SULT2B1b)两天后的C57BL/6小鼠腹腔内注射25HC,建立高浓度外源性或内源性25HC3S的小鼠模型；应用[3H]标记25HC3S并经尾静脉注射小鼠体内,追踪25HC3S在各组织器官中的分布及其药代动力学：采用实时定量PCR,细胞周期PCR芯片以及免疫印迹法检测相关基因的表达水平。以PCNA为增生标记,应用免疫组织化学技术分析肝脏中PCNA的阳性细胞数。结果：外源性25HC3S给药后在小鼠体内广泛分布于各组织器官,并在注射后48小时左右减至初始剂量的一半25HC3S的增加上调了肝脏内增生相关基因Wtl, Pcna,cMyc, cyclin A, FoxM1b, CDC25b的表达,却下调了细胞周期停滞基因Check2以及凋亡诱导基因Apafl的表达；无论外源性给药还是内源性合成,25HC3S的应用均有效增加了PCNA阳性细胞率,降低了LXR信号转导通路下游基因如ABCA1和SREBP-lc的表达；最后,LXR的人工合成激动剂T0901317的应用有效阻止了25HC3S诱导的PCNA表达升高。结论：25HC3S能够促进肝脏增生。羟基胆固醇硫酸化通过对LXR信号转导通路的抑制为肝脏增生的研究提供了新的靶点。综上所述,羟基类固醇硫酸基转移酶(SULT2B1b)通过硫酸化羟基胆固醇,增加硫化羟基胆固醇(25HC3S)的产生,抑制LXR信号转导通路活性,从而促进肝脏增生以及肝脏损伤后的再生恢复。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575

【参考文献】