Hif-1靶基因Bnip3在肝星状细胞活化中调控自噬机制的研究

发布时间：2020-04-06 23:02

【摘要】：目的:肝星状细胞活化是肝纤维化发生发展的关键机制,其活化过程中发生的表型改变已获得认识,但是导致这一系列表型改变的精细机制仍知之甚少。本课题组前期已证实缺氧诱导因子-1(Hif-1)通过调节自噬影响肝星状细胞的活化,通过全基因组表达芯片分析缺氧诱导的肝星状细胞内自噬相关基因的表达,筛选到与自噬相关的Bnip3(Bcl-2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3)蛋白。在此基础上开展本课题,旨在探讨核转录因子Hif-1靶基因Bnip3调控肝星状细胞活化和自噬的可能机制,以进一步揭示肝纤维化发生发展的相关机制,寻找逆转肝纤维化的靶点。方法:采用氯化钴(CoCl_2)化学诱导缺氧法刺激人肝星状细胞系LX-2细胞,qPCR和Western blot检测LX-2细胞中Bnip3的表达;以日本血吸虫感染小鼠为肝纤维化动物模型,用免疫组织化学染色法检测小鼠肝脏组织中Bnip3的表达;对LX-2进行缺氧处理,Western blot检测P62、α-SMA以及LC3B表达,免疫荧光染色技术检测P62,观察LX-2细胞自噬;用Hif-1抑制剂YC-1抑制Hif-1的表达,缺氧或LPS刺激LX-2细胞,用Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3表达;用特异性siRNA干扰Bnip3表达,用Western blot检测LX2在缺氧或LPS刺激下α-SMA、LC3B表达;胶原酶消化-Percoll分离法分离BALB/c小鼠的原代肝星状细胞,用Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中Hif-1、Bnip3和自噬相关分子LC3B和P62以及活化相关分子α-SMA的表达,用免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测GFAP、Bnip3及P62的表达;在原代肝星状细胞体外自然活化过程中加入Hif-1抑制剂YC-1,Western blot和免疫荧光染色激光共聚焦显微镜检测Bnip3的表达,用特异性siRNA干扰Bnip3表达,Western blot检测原代肝星状细胞自然活化过程中α-SMA和LC3B表达。结果:缺氧处理的人肝星状细胞LX-2和血吸虫肝纤维化小鼠肝脏组织中Bnip3分子表达升高;LX-2缺氧处理后发生自噬;抑制LX-2细胞中Hif-1α表达可减少Bnip3的表达;干扰LX-2细胞中Bnip3表达可阻抑LX-2细胞自噬发生并抑制细胞活化;小鼠原代肝星状细胞在体外自然活化过程中Bnip3表达升高;原代肝星状细胞自然活化过程中发生自噬且Hif-1α表达升高;抑制原代肝星状细胞中Hif-1α表达,Bnip3表达不再升高;干扰原代肝星状细胞中Bnip3表达,影响肝星状细胞活化和自噬发生。结论:Hif-1通过靶分子Bnip3调控的肝星状细胞活化和自噬。
【图文】：

自噬,星状细胞,免疫荧光染色

图 2. LX-2 人肝星状细胞缺氧处理后发生自噬。（A-B）LX-2 细胞用 CoCl2诱导缺氧，分别收集 0h 和 8h的细胞总蛋白, Western blot 检测自噬相关蛋白 P62 和 LC3B 的表达。该实验用不同批次样品重复 3 次，结果用 Mean ±SD 表示。**：P< 0.01。（C）将部分 LX-2 细胞接种于放置了无菌盖玻片的六孔板中，给予LX-2 细胞 CoCl2处理，免疫荧光染色检测自噬相关分子 P62 的表达，在荧光显微镜下拍摄（200×，红色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；蓝色：DAPI）。3．抑制 LX-2 细胞中 Hif-1α 表达可减少 Bnip3 的表达为了探究 Hif-1 与 Bnip3 在 LX-2 细胞中的关系，用 Hif-1 抑制剂 YC-1 抑制 LX-2 中 Hif-1 表达，缺氧刺激 8h，Western blot 检测 Bnip3 和 Hif-1 蛋白的表达，Bnip3 的表达随 Hif-1 的抑制而减少。为了扩大本研究的意义，我们还利用炎症因子脂多糖 LPS 刺激细胞，Western blot 结果同样提示，抑制 Hif-1 表达则导致 Bnip3 表达降低，具有统计学意义(图 3A 和图 3B)；Hif-1 对 Bnip3 的调控在细胞学水平也予以证实，YC-1预处理的LX-2细胞在缺氧或LPS刺激8h后，免疫荧光染色法检测Bnip3的表达，在激光共聚焦显微镜下观察到Bnip3在CoCl2

自噬,抑制剂,细胞,特异性

图 3.抑制 LX-2 细胞中 Hif-1α 表达可减少 Bnip3 的表达。（A-B）LX-2 在 Hif-1 抑制剂 YC-1 的处理下，给予细胞 100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，在 0h、1h 和 8h 收集细胞内总蛋白，Western blot 检测 Hif-1、Bnip3 的表达。该实验用不同批次样品重复 3 次，结果用 Mean ±SD 表示，*：P< 0.05，**：P< 0.01，，***：P< 0.001。（C）在六孔板中放入无菌的盖玻片，接种 LX-2，在 Hif-1 抑制剂 YC-1 的处理下，给予细胞100umol CoCl2或 2ug/ml LPS 刺激，免疫荧光染色检测 Bnip3 的表达，在激光共聚焦显微镜下拍摄（400×，红色：P62，Alexa Fluor 555 Conjugate；蓝色：DAPI）。4．干扰 LX-2 细胞中 Bnip3 表达可阻抑 LX-2 细胞自噬发生并抑制细胞活化。我们进一步使用特异性 siRNA 干扰 Bnip3 在 LX-2 细胞中的表达，观察 LX-2细胞中 Bnip3 的表达降低是否对细胞的自噬和活化有影响。使用 50nM siRNA 转染细胞 18h 后，用 CoCl2或 LPS 诱导细胞 8h，Western blot 检测到，Bnip3 被特异性 siRNA 抑制表达后，CoCl2或 LPS 诱导的自噬标记分子 LC3B 不再增多；肝星状细胞活化相关分子 -SMA 的表达也有明显下降，具有统计学意义（图 4A和 4B）。上述结果说明 Hif-1 靶分子 Bnip3 调控 LX-2 细胞的活化和自噬。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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