肝衰竭黄疸症阴阳不同属性患者外周血DCs与TCs免疫功能的研究

发布时间：2020-04-10 21:43

【摘要】：第一部分健康人外周血树突状细胞体外培养鉴定 目的： 建立外周血树突状细胞(dendritic cells,DCs)体外培养方法 方法： 无菌条件下取健康人新鲜外周血20ml,提取(密度梯度离心法)单个核细胞(PBMCs),取贴壁细胞完全培养基中(含重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)1000U/ml、重组人白细胞介素4(rhlL-4)500U/ml、重组人肿瘤坏死因子α[(rhTNF-a)20ng/ml诱导培养DCs,倒置显微镜下观察基体外培养过程中形态特征,在透射电镜下分析DCs细胞内部结构,使用流式细胞仪对DCs进行鉴定并检测其表型分子的表达。 结果： 经本实验体系从外周血PBMCs可诱导DCs生成量为每20m1约(1.3～3.6×106),透射电镜证实呈典型的DCs细胞形态学,用流式细胞仪检测DCs的表型分子,并且用ELISA试剂盒检测DCs上清液中IFN-α、IL-4的分泌水平。DCs的表达分别为FITC-CD1α44.57±3.12%.PE-HLA-DR90.45±4.37％、FITC-CD8078.92±2.18%.PE-CD8677.02±1.93%,FITC-CD8340.29±4.17%；IFN-α.IL-4分泌水平为28.56±8.31.37.77±10.28. 结论： 利用rhGM-CSF和rhIL-4、rhIFN-α可以从外周血中扩增出大量DCs,为DCs的研究和临床应用奠定了基础。 第二部分健康人外周血T淋巴细胞的分离提取 目的： 建立T淋巴细胞体外分离与提取的方法 方法： 取新鲜健康人血,经密度梯度离心法获得分离后的单个核细胞后移至37℃、5%C02培养箱孵育过夜。取上清液在其中加入T细胞尼龙毛柱,在5%C02培养箱中抚育1h,PBS冲洗后得到T淋巴细胞。 结果： 收集的淋巴细胞,直接用PE标记的鼠抗人CD3和CD8、FITC标记的CD4标记后,用流式细胞仪检测。结果显示,正常人CD3+、CD4+和CD8+、CD4/CD8的表达水平分别70.92士1.77%、42.95±2.01%、24.24±1.35%、1.78±0.07%。 结论： 本实验对T淋巴细胞的形态、表现进行初步观察和分析,为进一步开展对T淋巴细胞的深入研究和临床应用奠定基础。 第三部分HBV相关性肝衰竭黄疸症阴黄、阳黄证与外周血免疫细胞功能研究 目的： 本实验通过观察HBV相关性肝衰竭(本文以下简称肝衰竭)黄疸症患者阴黄证、阳黄证外周血树突状细胞及T淋巴细胞的功能,了解肝衰竭黄疸症阴黄证、阳黄证两症型的免疫表达的特点。 方法： 本研究纳入肝衰竭黄疸症患者,分为阳黄组与阴黄组两组,另设一组健康对照组,以外周血来源的PBMCs体外分离诱导培养DCs与T淋巴细胞,应用流式细胞计数检测DCs的表面分子HLA-DR、CD80、 CD86、CD83、CD1α,以及T细胞表面分子CD3、CD4与CD8,并检测DCs的上清液中IFN-α、IL-4的分泌水平,观察比较肝衰竭患者阴、阳黄证与免疫细胞及炎症因子表达的差异。 结果： 1.肝衰竭组与健康组比较,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80.CD86表达率降低；T细胞表面分子CD3.CD4表达及CD4/CD8比值降低,CD8表达上升,DCs分泌因子IFN-α、表达上升,差异有统计学意义(P0.05或0.01)。 2.阳黄组与健康组比较,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80、CD86表达率降低；T细胞表面分子CD3、CD4表达及CD4/CD8比值降低,CD8表达上升；DCs分泌因子IFN-α差异有统计学意义(P0.05或0.01),IL-4无统计学意义(P0.05)。 3.阴黄组与健康组比较,其DCs表面分子HLA-DR、CD1α、CD83、 CD80、CD86表达率降低；T细胞表面分子CD3、CD4表达及CD4/CD8比值降低,CD8表达上升；DCs分泌因子IFN-α、 IL-4表达上升,差异有统计学意义(P0.05或0.01) 4.肝衰竭患者阳黄组、阴黄组之间DCs表面分子HLA-DR、 CD1α、 CD80及TCs表面分子CD3、CD4之间无统计学意义(P0.05),阴黄组与阳黄组比较,DCs表面分子CD83、CD86及TCs的CD4/CD8比值低于阳黄组,TCs表面分子CD8上升,DCs分泌因子IFN-α表达降低,IL-4表达升高,差异有统计学意义(P0.01)。 结论： 1.HBV相关性肝衰竭患者的DCs、TCs的功能状态表现为细胞免疫功能低下,及炎症因子IFN-α的增高。 2.阳黄证患者的DCs、TCs的功能状态表现为细胞免疫功能低下,及炎症因子IFN-α的增高。 3.阴黄证患者的DCs、TCs的功能状态表现为细胞免疫功能低下,炎症因子IFN-α、抗炎症因子IL-4同时存在增高。 4.阳黄证、阴黄证患者的DCs、TCs的功能状态比较,说明阴黄证患者的细胞免疫功能更为低下,阴黄证患者同时存在炎症因子IFN-α及抗炎症因子IL-4的增高。
【图文】：

2. DCs电镜下的形态特征收集培养9天的DCs,制成透射电镜标本观察，可见细胞体积比较大，，多成不规则圆形或梭形，细胞表面突起比较丰富，胞浆内粗面内质网丰富，线粒体结构较清楚，溶酶体丰富，核大而圆，核膜较清晰，染色质分布较均勾。鉴定结果如图所示：

2. DCs电镜下的形态特征收集培养9天的DCs,制成透射电镜标本观察，可见细胞体积比较大，多成不规则圆形或梭形，细胞表面突起比较丰富，胞浆内粗面内质网丰富，线粒体结构较清楚，溶酶体丰富，核大而圆，核膜较清晰，染色质分布较均勾。鉴定结果如图所示：
【学位授予单位】：湖南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.3

【参考文献】

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本文编号：2622741