金属硫蛋白2对小鼠肝纤维化的干预作用及机制研究

发布时间：2020-04-19 04:50

【摘要】：目的:观察MT2缺失在四氯化碳致小鼠肝脏功能损伤及肝纤维化中的作用,探讨MT2抗肝纤维化效应及可能机制,为临床防治创伤、慢性炎症引起的肝功能异常和肝纤维化提供实验依据。方法:1.动物模型的制备和分组取健康SPF级(18-22g)雄性C57BL野生型小鼠12只及应用CRISPR/Cas9敲除MT2构建MT2低表达组小鼠12只,随机分为4组:正常对照组(WT)(6只),MT2低表达对照组(MT-KO)(6只),野生型四氯化碳组(WT-CCl_4)(6只),MT2低表达四氯化碳组(MT-K0-CCl_4)(6只)。实验组均通过反复腹腔注射橄榄油稀释的四氯化碳溶液4周(四氯化碳和橄榄油以1:4体积比混匀,5ml/kg,每周两次)诱导肝纤维化,建立肝纤维化模型。对照组注射等体积橄榄油。第4周末称重后用4%水合氯醛(0.15mL/20g)腹腔注射麻醉后心脏取血收集血清和肝脏标本,-80℃保存,备用。2.血清学指标检查检测各组小鼠肝功能和相关炎症因子血清水平:丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TB)含量,ELISA检测血清中IL-6、TNF-α指标变化。3.组织标本的病理学检查HE、Masson和天狼星红染色观察肝组织病理及纤维化改变,Western Blot检测肝脏组织中α-SAM。4.肝脏组织中MT2和相关炎症因子指标的变化RT-PCR检测肝脏组织中MT2、IL-6、TNF-α、IL-10指标变化,免疫组化检测肝脏组织中F4/80的表达情况,Western Blot检测P65、p-p65表达水平。5.肝脏组织中Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白的表达ELISA检测肝脏组织中MDA、SOD指标变化,Western Blot检测肝脏组织中Nrf2、catalase、NQO-1、HO-1的表达。结果:1.MT2对CCl_4诱导的肝纤维化保护作用(1)野生型小鼠肝脏中MT2 mRNA表达明显高于敲基因小鼠,差异具有统计学意义(P0.05)。注射CCl_4后野生型小鼠体内MT2含量显著增加,对敲基因小鼠无明显影响。(2)与对照组相比,注射CCl_4后两种基因型小鼠均出现精神萎靡,摄食、活动减少,体重无明显增加。(3)对照组两种基因型小鼠血清AST、ALT、TB无明显差异,注射CCl_4后均出现不同程度增高,敲基因型小鼠明显高于野生型小鼠,差异具有统计学意义(P0.05)。(4)对照组两种基因型小鼠肝小叶排列整齐,无明显炎细胞浸润,仅在汇管区有少量蓝色纤维。注射CCl_4后两组小鼠均出现不同程度的肝小叶结构紊乱、炎性细胞浸润和纤维化,在敲基因组表现更为严重。(5)对照组两种基因型小鼠肝脏组织中α-SAM表达量低,两组无明显差异。注射CCl_4后均出现不同程度增高,敲基因型小鼠明显高于野生型小鼠,差异具有统计学意义(P0.05)。2.MT2通过调控炎症减轻肝脏损伤(1)ELISA检测对照组两种基因型小鼠血清中促炎因子IL-6、TNF-α含量低,两组无明显差异。注射CCl_4后均出现不同程度增高,敲基因型小鼠明显高于野生型小鼠,差异具有统计学意义(P0.05)。这与肝脏组织中RT-PCR检测结果一致。(2)免疫组化检测对照组两种基因型小鼠肝脏组织中F4/80+巨噬细胞少量散在分布,注射CCl_4后均出现不同程度增多,并向汇管区聚集,在敲基因型小鼠更为显著。(3)Western Blot检测对照组两种基因型小鼠肝脏组织中P-P65表达低,注射CCl4后出现不同程度增高,以敲基因型小鼠更为明显,差异具有统计学意义(P0.05)。3.MT2通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻肝脏氧化应激损伤(1)对照组中,两种基因型小鼠肝脏中MDA、SOD含量相近,注射CCl4后MDA明显增高、SOD表达在明显降低,在敲基因型小鼠更为显著。(2)Western Blot检测两种基因型小鼠肝脏组织中Nrf2表达量无明显差异,注射CCl4后均出现不同程度增高,其下游抗氧化相关蛋白catalase、NQO-1、HO-1的表达增高,在野生型小鼠更为明显。结论:1、金属硫蛋白2(MT2)缺失加重CCl_4诱导的肝脏组织炎症细胞浸润、纤维化和肝组织损伤;2、金属硫蛋白2(MT2)对肝纤维化调控作用可能通过下调NF-κB P65信号通路抗炎和上调Nrf2/HO-1信号通路抗氧化应激来实现。
【图文】：

1.1 不同基因型小鼠中MT2含量差异为确保实验的可靠性，，本实验首先通过鼠尾基因提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳确定实验小鼠MT2是否敲除成功，结果如图1-1A所示，仅在800bp处显示条带为纯合子（MT-KO）（除3、12泳道外其它泳道），仅在2300bp处显示条带为野生型小鼠（WT）（第3泳道）。同时通过RT-PCR检测两种基因型小鼠肝脏组织中MT2 mRNA表达情况，结果如图1-1B所示，对照组野生型小鼠肝脏组织中MT2 mRNA的表达量明显高于敲基因小鼠（P＜0.05）。经CCl4处理的野生型组小鼠肝脏组织中MT2 mRNA的表达量显著增加，对敲基因小鼠MT2无影响（P＜0.05）。图1-1A MT2基因扩增 B 肝脏中MT2 mRNA表达量.注：#P＜0.05 VS.野生型正常对照组.*P＜0.05 VS.野生型CCl4对照组.Fig.1-1AThe amplification of MT2 gene, B MT2 mRNA expression in liver .Note:Data were expressed as mean ± SD.#P＜0.05 VS the wide-type control group.*P＜0.05 VS thewide-type CCl4control group.1.2 一般情况对照组小鼠精神、饮食、活动正常，性情温顺，体重逐渐增加，毛发光泽。实验组小鼠腹腔注射橄榄油稀释四氯化碳溶液后逐渐出现精神萎靡，摄食、活动减少

1.3 肝功能检测为了探讨MT2是否具有改善肝功能作用，我们通过检测小鼠血清中AST、ALT和TB水平。结果如表5及图1-3所示：与对照组相比，CCl4组AST、ALT和TB显著增高（P＜0.05），其中MT-K0-CCl4组AST、ALT和TB升高程度均高于WT-CCl4组，血清肝指数的变化意味着MT2具有缓解CCl4的肝毒性作用。表5 肝功能检测组别 n AST(U/L) ALT(U/L) TB(U/L)WT 6 15.04±5.74 14.75±2.84 7.65±2.75MT-KO 6 15.76±5.94 14.42±3.92 7.79±2.83WT-CCl46 37.23±6.53*#46.01±5.63*#50.97±8.79*#MT-KO-CCl46 50.59±7.52&*58.51±10.02&*61.18±13.59*图1-3 肝功能检测注：#P＜0
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.2

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本文编号：2632944