树突状细胞的TLR信号通路在炎症性肠病（克罗恩病）的变化及雷公藤甲素干预机制

发布时间：2020-04-22 04:45

【摘要】：克罗恩病(Crohn disease,CD)属于炎性肠病(inflammatory bowel diseases,IBD),临床表现为消化道节段性的炎性损伤,严重影响患者的生存质量。该病在欧美国家较常见,近年来由于生活方式的改变、环境的变化及诊疗水平的提高,我国医生在临床工作中发现克罗恩病的发病率有增多的趋势。由此带来纷繁复杂的临床问题,引起专业医生的高度重视。克罗恩病的病因及发病机制尚未清楚。目前的研究主要集中在遗传易感性、免疫调节紊乱、感染及环境因素等环节上。在克罗恩病治疗方面,由于发病机制并不完全明了,因此其治疗研究进展缓慢,目前常用的药物治疗效果并不理想,且并发症较多。因此,深入揭示克罗恩病发病机理,探寻高效、低毒的治疗方法一直是胃肠病学家致力于研究的方向。临床和动物实验研究表明,肠黏膜对肠道共生菌的免疫耐受缺失是克罗恩病的主要发病机制。树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是公认的具有T细胞活化作用和启动抗原特异性免疫反应的细胞,在克罗恩病的发病中具有重要作用,是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞,被认为是连接特异性免疫应答和非特异性免疫应答的桥梁,并且可决定机体特异性免疫应答的类型。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是DCs识别肠道微生物病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)而将其区分的重要工具。肠道DCs可表达多种TLR,而不同的TLR亚型具有不同的外源性配基。目前研究表明,TLR2、TLR4、TLR5和TLR9与肠黏膜稳态和炎性病变有关,且不同的TLR亚型在炎性病变中具有不同的作用。虽然DCs在肠黏膜稳态和免疫耐受缺失中起到重要的作用,有关TLR在克罗恩病发病机理中的作用的研究也备受关注,但基于DCs的TLR信号通路在克罗恩病病理生理中的作用尚不完全清楚。雷公藤多甙具有抗炎和免疫抑制等作用,临床已广泛用于类风湿性关节炎和肾小球肾炎等多种自身免疫性疾病的治疗,疗效显著。我们的临床研究发现,雷公藤多甙能够有效的治疗克罗恩病,既可以诱导疾病缓解又可以维持缓解,有些病例应用雷公藤多甙甚至取得意想不到的良好效果。雷公藤甲素(triptolide,TP)是雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物,是雷公藤多甙的主要有效成分之一。我们研究发现,雷公藤甲素能够有效的缓解克罗恩病模型小鼠(IL-10基因敲除小鼠)的肠组织炎症,小鼠的存活率和生存状态显著改善。这一作用可能与其能够抑制多种Thl型细胞因子的表达有关。提示雷公藤甲素具有显著的抗炎和免疫抑制作用,对于CD的治疗具有潜在的优势,但是确切的机制尚未完全明了。本课题以IL-10--小鼠和克罗恩病患者肠标本为研究对象,通过在体实验和离体实验探讨DCs的TLR信号通路变化在克罗恩病病理生理中的作用和雷公藤甲素的影响,从而为阐释克罗恩病的病理生理、为临床应用雷公藤多甙治疗克罗恩病奠定理论基础,从而为发病率日益增加的克罗恩病提供一种经济有效的治疗方法。第一部分在体研究肠道组织TLR信号通路在克罗恩病模型中的表达和雷公藤甲素的影响目的:将IL-I0-/-小鼠作为克罗恩病模型,观察其相对与野生型小鼠TLR信号通路的变化,以及雷公藤甲素对模型小鼠的TLR信号通路的影响。材料和方法:建立IL-10-/-小鼠慢性肠炎模型。5-6周龄雄性IL-10-/-小鼠,随机分为两组。Triptolide组:IL-10-/-小鼠隔日腹腔注射雷公藤甲素(0.07 mg/kg);Control组:IL-10-/-小鼠隔日腹腔等量注射生理盐水。部分实验加取同背景同龄野生型小鼠做对照。Control组和Triptolide组隔日给药,连续给药8周。观察小鼠结肠组织病理学变化,酶联免疫吸附测定(ELISA)结肠组织MPO的改变,激光共聚焦显微镜观察结肠组织TLR2和TLR4的变化,实时定量聚合酶链反应实验(RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)法测定TLR2、TLR4的基因和蛋白表达变化以及下游分子MyD88的变化。结果:雷公藤甲素可以显著减轻结肠慢性炎症,降低组织病理学评分,减少结肠MPO的表达,TLR2和TLR4在IL-10-/-小鼠结肠组织表达高于野生型小鼠,雷公藤甲素可以抑制IL-10-/-小鼠TLR2和TLR4在结肠的表达,并且抑制其下游分子MyD88的表达。结论:TLR信号通路在IL-10-/-小鼠结肠组织中被激活,雷公藤甲素能够通过调节IL-10-/-小鼠的TLR信号通路,抑制肠道炎症。第二部分在体研究肠道组织树突状细胞TLR信号通路在克罗恩病模型中的表达和雷公藤甲素的影响目的:分离提取IL-10-/-小鼠结肠树突状细胞,观察雷公藤甲素对IL-10-/-小鼠结肠树突状细胞TLR信号通路的影响。材料和方法:5-6周龄雄性IL-10-/-小鼠,随机分为两组。Triptolide组:IL-10-/-小鼠隔日腹腔注射雷公藤甲素(0.07 mg/kg);Control组:IL-10-/-小鼠隔日腹腔等量注射生理盐水,连续给药8周。采用磁式细胞分选法分离提取小鼠结肠树突状细胞,检测纯度和存活率后,提取细胞总RNA,行Real time PCR检测树突状细胞的TLR2、TLR4、MyD88的基因表达,提取细胞的总蛋白及核蛋白,免疫印迹(Western Blot)法测定TLR2、TLR4的蛋白表达以及核蛋白中NFkB表达的变化。结果:流式细胞仪检测分选出的树突状细胞(CD11c标记)纯度在90%以上,台盼蓝染色鉴定细胞存活率为90%以上。雷公藤甲素可以显著抑制结肠树突状细胞TLR2和TLR4的基因和蛋白水平表达,并且抑制下游分子MyD88的mRNA基因表达以及核蛋白中NFkB的表达。结论:采用磁式细胞分选方法分离提取肠树突状细胞,简便易行,分离的纯度和存活率高,方法可靠。雷公藤甲素能够抑制树突状细胞TLR信号通路,树突状细胞是雷公藤甲素的作用的重要靶细胞。第三部分离体研究树突状细胞TLR信号通路在克罗恩病中的表达和雷公藤甲素的影响目的:取术中切除结肠型克罗恩病患者病变结肠标本并提取树突状细胞,观察和分析TLR2、TLR4及NFkB的基因和蛋白水平表达,并观察雷公藤甲素干预后的变化,探讨雷公藤甲素对克罗恩病患者结肠组织和树突状细胞TLR信号通路的影响。材料和方法:取术中切除结肠型克罗恩病患者病变结肠标本,随机分为Control 组和 Triptolide 组。将组织放入含 125ug/ml 的 Zymosan 和 50 μ g/ml Lipoteichoicacid(LTA)(TLR2 配体)及 10 ug/ml lipopolysaccharide(LPS,TLR4配体)的CMRL-1066组织培养液中培养24小时,Triptolide组加入20ng/ml的雷公藤甲素。提取组织总RNA,逆转录后行realtimePCR检测树突状细胞的TLR2、TLR4的基因表达。磁式细胞分选法分离纯化结肠组织树突状细胞,随机分为Control组和Triptolide组。放入含上述TLR配体的RPMI1640培养液中培养24小时,Triptolide组加入20 ng/ml的雷公藤甲素。取各组细胞孵育24小时后的培养基上清,ELISA检测培养基上清中TNF-α、INF-γ、IL-4、IL-5的水平。流式细胞仪测细胞表面共刺激分子MHCⅡ、CD86的表达,提取细胞的RNA及蛋白,real time PCR及免疫印迹(Western Blot)法测定TLR2、TLR4、MyD88 及 NFkB 的表达。结果:雷公藤甲素可以抑制克罗恩病患者结肠组织TLR2和TLR4的表达;雷公藤甲素可抑制细胞培养上清中细胞因子TNF-α、INF-γ的水平,对IL-4、IL-5的水平无明显影响;雷公藤甲素可抑制树突状细胞表面共刺激分子MHCⅡ、CD86的表达,雷公藤甲素可以抑制树突状细胞TLR2、TLR4以及下游分子MyD88和NFkB的表达。结论:雷公藤甲素体外够降低Th1型细胞因子的表达,对Th2型细胞因子无明显作用,克罗恩病是以Th1型细胞因子占主导地位的炎症反应,进一步奠定雷公藤甲素治疗克罗恩病的理论基础;雷公藤甲素可抑制DCs表面的共刺激分子的表达,即能够改变DCs的成熟状态,从而诱导免疫耐受;雷公藤甲素对于克罗恩病患者的结肠组织和细胞水平均能够抑制TLR/NFkB信号通路,对其用于CD病人进一步提供了理论基础。总结一、雷公藤甲素对于克罗恩病模型小鼠具有良好的治疗效果,TLR信号通路在克罗恩病模型小鼠发病中具有重要作用,雷公藤甲素可以通过作用TLR信号通路调节异常的肠粘膜免疫,抑制炎症反应。二、雷公藤甲素不仅对于克罗恩病模型小鼠的TLR信号通路有干预作用,还可以作用于克罗恩病患者病变肠道组织和树突状细胞的TLR信号通路,为临床治疗克罗恩病提供了理论基础。三、体内体外研究均表明树突状细胞是雷公藤甲素作用的重要靶细胞,推测靶向干预树突状细胞的TLR信号通路可能为治疗克罗恩病提供新的策略,这有待进一步证实。
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R574.62

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