多药耐药基因多态性与炎症性肠病的临床研究

发布时间：2020-04-25 20:49

【摘要】： 目的探讨多药耐药基因(MDR1)多态性(C3435T和G2677T/A)与我国炎症性肠病的临床关联。方法收集临床确诊的71例IBD患者(60例UC,11例CD)外周抗凝血,提取DNA,采用多聚酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性方法测定MDR1的多态性。同时记录IBD患者的病史和相关检查结果,记录UC患者使用激素的治疗反应,用于分组比较。对照组为性别匹配、年龄基本匹配的无消化道症状的健康体检者。调取60例确诊UC患者结肠镜检查的粘膜活检病理蜡块,同时留取门诊结肠镜检查正常的健康对照者的结肠粘膜,共20例。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶(SP)法,了解结肠粘膜Pgp的表达变化。结果⑴UC患者临床资料分析:60例UC患者男性多于女性,男女性别比例1.3:1,平均发病年龄38.7±13.0岁,20~40岁为发病高峰,平均病程3.7±4.3年。其中伴肠外表现者:胆结石4例(6.6%),口腔溃疡5例(8.3%),坏疽性脓皮病1例(1.6%)。使用口服激素或静脉激素治疗共30例(50%),其中激素耐药或依赖5例(16.6%),使用免疫抑制剂硫唑嘌呤治疗2例(6.7%)。临床类型以慢性复发型(41例,68.3%)和初发型(13例,21.7%)为主,慢性持续型5例(8.3%),暴发型1例(1.7%)。病变范围以全结肠型为主(25例,41.6%),直肠/直乙状结肠型21例(35%),广泛结肠型7例(11.7%),左半结肠型7例(11.7%)。活动期UC中全结肠炎患者及广泛结肠炎患者病变严重度以重度为主,而左半结肠炎患者及直肠/直乙状结肠炎患者病变严重度以轻度为主。病变范围与临床类型无关。⑵CD患者临床资料分析:11例CD患者平均发病年龄36.3±12.4岁,平均病程2.6±1.9年,男女性别比1.2:1。病变类型以非狭窄、非穿孔型(5例,45.5%)和狭窄型(5例,45.5%)为主,穿孔型1例(9.0%),伴肛周病变2例(18.2%)。病变部位以回肠型及回结肠型居多(分别为27.2%和36.4%)。行左半结肠切除术1例(9.1%)。使用激素治疗共6例(54.5%),其中强的松联合免疫抑制剂硫唑嘌呤治疗共4例(36.4%)。⑶MDR1基因型分析:病例组和对照组中MDR1 C3435T和G2677T/A基因分布符合Hardy-Weinberg平衡(P0.05)。病例组中MDR1 C3435T基因型频率分别为CC型38.0%,CT型45.1%,TT型16.9%;MDR1 G2677/A基因型频率分别为GG型33.8%,GA型25.4%,GT型11.2%,TT型15.5%,TA型9.9%,AA型4.2%。MDR1 C3435T和G2677T/A各基因型在病例组和对照组中总体分布没有差别。C3435T TT基因型频率和T等位基因频率在IBD组和对照组中分布无显著差异,比较G2677T/A TT型基因频率和T等位基因频率在两组中的分布,也未发现统计学差异。C3435T各基因型与UC病变范围及病变严重度均无关。G2677T/A TT基因型在直肠/直乙状结肠炎中占有明显优势(P=0.048,OR 3.375(1.01~11.279)),但与UC病变严重度无关。观察记录全身应用糖皮质激素治疗的UC患者,按糖皮质激素治疗反应,分为激素有效组和激素依赖或耐药组。比较发现激素有效组与对照组相比MDR1基因型分布无统计学差异。C3435T TT基因型频率和T等位基因频率以及G2677T/A TT基因型频率和T等位基因频率在上述各组分布均无差异。⑷Pgp免疫组化结果:在UC病例组Pgp表达阳性率65%(39例),对照组Pgp表达阳性率55%(11例),两组Pgp阳性率无显著差异(χ2=0.640,P=0.424)。其中病例资料完整共37例,按照UC病变严重程度分组后比较,发现在UC轻度活动组Pgp表达阳性率最高(80%),但是与对照组及UC中度组、重度组相比,无统计学差别(P0.05)。结论(1)UC以青壮年发病居多,住院病例中累及全结肠多见。临床类型以慢性复发型为主。活动期UC中,病变范围与病变严重度有关。CD病变以非狭窄非穿孔型及狭窄型为主,病变部位以回肠及回结肠居多。(2)MDR1基因多态性在IBD组与对照组之间分布无差异。各基因型与UC病变严重度无关,但可能会影响UC病变范围,G2677T/A TT基因型与直肠/直乙状结肠炎明显相关。(3)未发现MDR1基因多态性与UC激素疗效相关,但由于样本量较少,进一步大样本研究仍有必要。(4)UC结肠粘膜Pgp表达与正常人相比无显著差异,UC病变严重度与Pgp表达无明显相关。
【图文】：

基因型,反应体积

MDR1 基因多态性。PCR 反应体积 20ul，含 10×buffer 2ul，1.5mmol/L MgC0.2mmol/L dNTP，10mmol/L 引物，2U Taq DNA 聚合酶，8.2ul 双蒸水。2.2.3.3.1C3435T 基因型测定C3435T 引物，正向：5’-TGC TGG TCC TGA AGT TGA TCT GTG AAC-3’；反5’-ACA TTA GGC AGT GAC TCG ATG AAG GCA-3’[15,26]。PCR 反应条件：9变性 5min，再变性 1min，58°退火 1min，72°延伸 1min，共 35 个循环，72°再5min。PCR 产物用 MboI 酶切，反应体积 20ul，含 10×NEB 缓冲液 2uL，PC物 5uL，MboI 0.5uL，双蒸水 12.5uL。37°水浴 2h。2%溴乙锭琼脂糖凝胶电泳泳条件 100V，电泳 1h。凝胶成像系统摄片观察结果。PCR 扩增产物 238bp。经 MboI 酶切后 2%琼脂糖电泳分析显示：TT 型（238CT 型（238bp、172bp、60bp），CC 型（172bp、60bp）。由于 60bp 片段较小泳后条只显示 238bp、172bp。如图 1。

基因型,产物

退火温度 56.5°，其余条件同 C3435T。PCR 产物经 BanI （NEB 公司）37切 2h，反应体积 20uL，，含 10×NEB 缓冲液 2uL，PCR 产物 5uL，MboI 0.5蒸水 12.5uL。G2677T 退火温度 53°，PCR 产物经 BsrI（NEB 公司） 65°水2h，反应体积同上。酶切产物经 2%溴乙锭琼脂糖凝胶电泳，100V，电泳胶成像系统摄片观察结果。G2677T PCR 产物 224bp。经 BanI 酶切电泳显示（如图 2）：（1）两条带（26bp）：GG 型；（2）一条带（224bp）：基因型可能是 TT 型、TA 型、AA 三条带（224bp、198bp、26bp）：基因型可能是 GT 型、GA 型。后两者需G2677A 引物再次行 PCR， PCR 产物 220bp。经 BsrI 酶切，能将带有 A 等的 DNA 切开，故对于前者第二种情况的，酶切后分型如下：TT 型（220b型（220bp、206bp、14bp），AA 型（206bp、14bp）。对前述第三种情况的后分型如下：GT 型（220bp），GA 型（220bp、206bp、14bp）。由于 14b片段太小，电泳后只能显示出 224bp、198bp、220bp、206bp。如图 3 所示
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R574.62

【共引文献】