TLR7在HCV感染过程中的免疫激活及胞内区功能研究

发布时间：2020-04-25 23:09

【摘要】：HCV是一种正单链RNA病毒,能够通过感染宿主细胞,引发机体病毒性肝炎、肝纤维化乃至肝癌的发生。HCV的感染往往伴随机体因天然免疫而引发的慢性炎症反应,此过程有众多模式识别受体的参与。 Toll样受体是一类通过识别病原相关分子模式,介导机体天然免疫,并能作为桥梁连接机体天然免疫与获得性免疫的一类重要模式识别受体。Toll样受体能够识别多种病原微生物的固有成分,介导机体针对多种病原菌与病毒的免疫反应。 TLR7存在于细胞内体表面,通过识别包括I型HIV、手足口病及A型流感病毒在内的多种单链RNA病毒,介导机体抗病毒免疫。TLR7被其配体激活后,通过下游接头蛋白分子MyD88将激活信号向下游传递,最终激活转录因子NF-κB,进而产生多种促炎因子与I型干扰素,引起机体炎症反应。TLR7属于I型跨膜蛋白,由胞外区、跨膜区与胞内区组成。其胞外区由多个富含亮氨酸的LRR区组成,主要参与TLR7与其配体的识别,跨膜区主要负责TLR7分子的锚定,而胞内区则负责TLR7激活信号转导过程。目前虽然研究发现多种单链RNA病毒感染所激活的天然免疫反应均有TLR7分子参与,但在HCV感染机体所引起的天然免疫应答过程中,TLR7的所起的作用尚不明确。此外,虽然TLR7分子通过其胞内区将激活信号向下传递,但TLR7分子胞内区介导信号转导的具体机制还不清楚。根据以上研究背景,本研究从HCV感染所激活机体天然免疫反应入手,阐明TLR7在HCV感染过程中的作用,并进一步从蛋白一级结构影响功能的角度,解释了TLR7被激活后通过胞内区进行信号传递的具体机制。因此本研究主要从HCV感染过程中TLR7分子的作用与TLR7分子胞内区结构对信号传递的影响两个方面,分为如下两个部分进行: 1. HCV感染过程中TLR7分子的作用本研究首先利用稳定转染HCV基因组的Huh7细胞所表达的HCV全基因组RNA刺激外周血单核细胞(PBMCs),通过ELISA检测细胞因子表达量,我们发现HCV基因组RNA能够刺激PBMCs显著上调TNF-α与IFN-α。因此证实HCV可以通过其单链RNA基因组激活机体天然免疫反应。由于TLR7天然状态下的配体为单链RNA病毒,因此该激活很可能通过TLR7介导。由于在细胞内体中病毒基因组将被降解成许多大小不等的寡聚核苷酸片段(ORNs),因此我们根据TLR7识别序列特点,以HCV基因组为模板人工合成多条ORNs,并用这些ORNs刺激新分离的PBMCs细胞,通过ELISA检测我们证实位于1000位的ORN1000与位于HCV 3’端尾部的ORNHCVtail能够刺激PBMCs上调TNF-α与IFN-α的表达。 TLR7被配体激活后将活化转录因子NF-κB与IRF7,从而启动基因的表达。因此,我们利用人工合成的ORNs刺激Huh7细胞,通过双荧光素酶报告基因检测我们发现ORN1000与ORNHCVtail可以激活NF-κB与IRF7。为了确定TLR7是否真的参与HCV感染过程所引起的免疫激活,我们通过RNA干扰技术发现当TLR7被干扰时, ORNs刺激细胞所造成NF-κB的激活强度明显下降。而通过质粒转染使TLR7过表达后,NF-κB的激活强度显著提高。因此,我们确定HCV基因组片段对于机体天然免疫反应的激活能够通过TLR7进行的。 2. TLR7分子结构对信号传递的影响 TLR7分子被激活后能够通过一系列的信号转导途径激活基因表达。虽然TLR7通过胞内区募集接头蛋白MyD88从而激活信号通路已比较清楚,然而该分子具体通过胞内区哪些位点介导对MyD88的募集却尚无定论。因此我们对TLR7胞内区蛋白的一级结构进行分析,以期筛选出对TLR7信号转导起关键作用位点,并解释其产生作用的机制。首先,我们分析了TLR7胞内区的序列特征,并且构建了胞内区全长与半长缺失体的真核表达质粒,通过对双荧光素酶报告基因检测NF-κB的激活情况,我们发现转染TLR7胞内区全长与半长缺失体的实验组与转染空质粒的阴性对照组之间均无差别,因此我们将TLR7胞内区的关键位点锁定在胞内区的后半段。接着,我们在胞内区后半段以大约20个氨基酸为间隔构建了一系列的缺失质粒。通过检测NF-κB激活情况,我们将关键位点锁定在一个含有16个氨基酸的区域。然后,我们通过一系列位点特异性点突变的方法,证明这16个氨基酸中存在2个分别位于1004位与1006位的精氨酸能够对TLR7功能产生影响。最后我们通过免疫共沉淀的方法证明,这2个精氨酸中只有1004位的精氨酸是通过影响TLR7与下游接头蛋白MyD88的结合来影响TLR7信号传递的。总之,本研究首先证实了HCV感染所引起的天然免疫反应由TLR7分子介导,TLR7分子激活信号的缺失将导致机体抗HCV感染免疫应答水平显著下降。而进一步对TLR7分子结构功能分析发现,TLR7胞内区位于1004位的精氨酸能够通过影响TLR7与下游接头蛋白MyD88结合的方式影响TLR7激活信号的转导过程。该发现进一步阐明了TLR7信号传递机制的分子基础,并为基于TLR7的临床诊断与治疗提供新的靶点。
【图文】：

天然免疫,寡聚核苷酸,机体,基因组

图 1 HCV 基因组 RNA 激活天然免疫应答Figure1. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV genomic RNAA and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-α aNF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. (C and D) PBMCs wesolated and plated in a 96-well plate. Increasing doses of HCV genomic RNA (from 0.o 0.5 μg/ml) were used to stimulate PBMCs, and IFN-α and TNF-α were determined LISA after stimulation for 18 h. Values represent mean value ± standard deviations hree independent experiments.（二）HCV 源寡聚核苷酸激活天然免疫天然状态下许多病毒入侵机体后将被细胞吞噬入内体，并在内体完成脱衣壳等。在内体内，许多病毒的基因组将被降解成寡聚核苷酸，而其中某些寡聚核苷酸(ORNs)能够刺激机体产生免疫反应。研究证明，pDC 对 HIV 病毒基因组中一段为 RNA40 的富含尿嘧啶的区域高度敏感，，以该区域序列为基础合成的 ORN 可[9]

天然免疫

图 2 HCV-ORN 激活天然免疫应答Figure2. Cytokine production by human PBMCs in response to HCV-ORNs and B) PBMCs were isolated and stimulated with HCV genomic RNA. IFN-αF-α were determined by ELISA after stimulation for 18 h. Values represent mean vstandard deviations of three independent experiments.三）HCV 源寡聚核苷酸激活 TLR7 信号通路HCV 感染是诱发肝细胞发生纤维化乃至癌变的重要因素，而 TLR7 信号通能在机体抵御 HCV 感染免疫过程中起重要作用。因此我们首先在肝癌细胞 He Huh7 内检测 TLR7 分子的表达情况。通过 Realtime PCR 与 Western blotting 检们发现 TLR7 分子在 Huh7 细胞中有表达（图 3A）。TLR7 被配体激活后经过一系列信号转导，最终激活转录因子 NF-κB 与 IRF动炎症细胞因子与 I 型干扰素基因的表达[18]。因此，为了验证根据 HCV 基因人工合成的 ORNs 是否通过激活 TLR7 信号通路引起天然免疫应答，我们在 H
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.63

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