单核细胞在外周血干细胞移植治疗终末期肝病中的作用及其机制探讨

发布时间：2020-04-28 12:02

【摘要】：粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)动员的外周血干细胞(Peripheral blood stem cells, PBSCs)移植,可导致血循环中中性粒细胞及血小板迅速增加,已成为造血干细胞移植的重要方法。然而,新近研究发现,PBSCs可向多种组织细胞分化,其在终末期肝病等多种损伤组织的修复过程中发挥了重要作用。动物实验表明,G-CSF可促进骨髓干细胞向损伤肝脏迁移,诱发内源性肝细胞再生。临床研究也证实,G-CSF动员或PBSCs移植均可有效改善终末期肝病患者的肝功能。本实验室前期研究发现,自体PBSCs经肝动脉回输可提高乙肝相关性终末期肝病患者的白蛋白(Albumin, ALB)水平和CTP(Child-Turcotte-Pugh)评分。然而,PBSCs中存在着多个亚群的干细胞,是哪一亚群的细胞在此过程中发挥了作用,尚不清楚。传统观点认为,外周血中的单核细胞是吞噬细胞的前体细胞,可定向分化为巨噬细胞和树突状细胞。近年来研究发现,循环中的单核细胞具有多向分化的潜能,可诱导分化为肝细胞、骨、心肌、神经细胞和内皮细胞等多种组织细胞。本课题组前期研究也证实,PBSCs中的单核细胞具有干细胞的潜能,可诱导分化为肝细胞样的细胞。另外,多项研究显示,循环中的单核细胞可能是肝硬化逆转的重要调节细胞。单核细胞功能敲除的小鼠,可延缓四氯化碳(Carbon tetrachloride,CCl4)诱导的肝纤维化降解的进程。同时,在损伤的肝脏,巨噬细胞可分泌肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体(TNF-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL),进而激活活化星形细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)上的死亡受体,诱导其调亡。然而,单核细胞是否为PBSCs移植治疗终末期肝病真正的效应细胞,在终末期肝病的干细胞治疗中发挥了重要的作用,尚不清楚。【实验目的】 1.检测PBSCs中CD14+单核细胞亚群的干细胞潜能;2.比较PBSCs中CD14+单核细胞和CD14-细胞移植对CCl4诱导的大鼠肝硬化的治疗作用;3.探讨CD14+单核细胞参与损伤肝脏修复可能的机制。【材料和方法】 1.利用G-CSF动员雄性大鼠的外周血干细胞,以Ficoll为介质通过密度梯度离心法分离PBSCs;2.通过免疫磁珠分选PBSCs中CD14+单核细胞亚群;3.利用形态学、流式细胞仪和细胞化学等检测,观察CD14+单核细胞亚群的干细胞潜能;4.将CCl4诱导的雌性肝硬化大鼠随机分为两组,每组30只,分别从门静脉输注CM-DiI染料标记的CD14+单核细胞或CD14-细胞(1x107cells/rat);5.通过生存分析、血清学和门静脉压力等检测,对比CD14+单核细胞和CD14-细胞移植对大鼠肝硬化的治疗效果;6.通过苦味酸天狼星红染色、Masson三色染色、免疫组化和Real-time PCR等方法,检测细胞移植对大鼠肝纤维化程度的影响;7.通过荧光示踪和Y染色体原位末端标记(Primed in situ labeling,PRINS)技术,观察移植的CD14+单核细胞在损伤肝脏的定植情况;8.通过激光共聚焦检测,观察损伤肝脏中定植细胞的性质;9.通过免疫组化和Real-time PCR等方法,观察单核细胞移植对肝细胞再生能力的影响;10.通过原位凝胶酶谱、凝胶酶谱、Western blot、Real-time PCR和激光共聚焦等方法,探讨单核细胞逆转肝纤维化可能的机制。【结果】 1.大鼠PBSCs中CD14+单核细胞亚群的分离及干细胞潜能的鉴定流式细胞仪结果显示,我们分离的PBSCs中的单核细胞,单核细胞标志物CD14和CD11b的表达率分别为95.4%±0.3%和93.7%±1.8%。该亚群的部分细胞可表达造血干细胞标志物CD34(1.1%±0.3%)、CD45(42.8%±4.6%),间充质干细胞标志物CD44(50.1%±4.3%)以及多能干细胞的转录因子Oct3/4(4.2%±1.1%)和Sox2(5.7%±1.5%)。然而,内皮细胞标志物CD133的表达则为阴性。另外,在塑料培养板上,该亚群细胞具有与单核细胞相似的良好的贴壁能力;在无外援性生长因子的作用下,RPMI 1640培养3-5天后,其呈现出干细胞特有的集落生长能力。以上结果说明,PBSCs中CD14+单核细胞亚群具有干细胞潜能。 2. PBSCs中CD14+单核细胞和CD14-细胞对大鼠肝硬化治疗效果的比较将CCl4诱导的雌性肝硬化大鼠随机分为两组,每组30只,分别从门静脉输注CD14+单核细胞或CD14-细胞。移植后4周,CD14+单核细胞移植组和CD14-细胞移植组大鼠血清中的ALT和AST水平较移植前均明显减低。然而,相比CD14-细胞移植,CD14+单核细胞移植可有效提高大鼠血清中ALB水平和生存率,降低门静脉压力(p 0.01)。另外,通过天狼星红染色、Masson三色染色和肝纤维化相关分子(FN、α-SMA和TGF-β)的检测,我们发现CD14+单核细胞移植组大鼠的肝纤维化程度(2.1%±0.9%)较CD14-细胞移植组(11.2%±2.3%)明显减低(p 0.01)。Real-time PCR结果证实,移植后1周,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝纤维化相关分子(FN,α2-(1)-procollagen,α-SMA和TGF-β)的mRNA表达较CD14-细胞移植组也明显降低(p 0.01)。 3.单核细胞促进损伤肝脏肝细胞再生的机制利用荧光示踪技术,我们发现CM-DiI染料标记的单核细胞在损伤肝脏中有定植,其主要分布于肝小叶的汇管区(86.9%±10.1%),少部分细胞位于肝实质区内(8.4%±2.5%)。PRINS结果也证实,移植的带有Y染色体的单核细胞在雌性肝硬化模型鼠中确有定植。激光共聚焦结果显示,这些定植的细胞中,仅有1.8%±0.4%的细胞具有肝细胞标志物ALB和CK18的表达;另外,肝巨噬/Kuffer细胞标志物F4/80的表达率为62.1%±9.8%,但肝干细胞标志物OV6和纤维母细胞标志物α-SMA的表达为阴性。免疫组化结果显示,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝细胞再生指数Ki-67的表达(移植后1周10.79%±2.98%,2周15.31%±3.24%)较CD14-细胞移植组(移植后1周6.16%±1.24%,2周8.45%±0.98%)明显增加(p 0.01)。Real-time PCR结果证实,移植后1周,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中肝细胞再生相关因子(HGF, TGF-α, EGF和VEGF)的mRNA表达,较CD14-细胞移植组也明显增高(p 0.01)。 4.单核细胞促进肝硬化逆转的机制通过原位凝胶酶谱和凝胶酶谱检测,我们发现:CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中MMP-2和-9的活性较CD14-细胞移植组明显增强;同时单核细胞移植后2周,肝组织中MMP-2和-9的分泌活性最高。Western blot结果显示,在CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中,不仅有MMP-2和-9蛋白表达的增加,而且MMP-13的表达也是增高的。Real-time PCR结果证实,移植后1周,相比CD14-细胞移植组,CD14+单核细胞移植组大鼠肝组织中MMP-2,-9和-13的mRNA表达增高;另外TIMP-1的mRNA表达降低(p 0.01)。激光共聚焦结果显示,部分定植的细胞可表达MMP-9和-13,但大部分MMP-9和-13的合成来源于内源性肝组织细胞。【结论】本研究证实了PBSCs中CD14+单核细胞具有干细胞潜能,该亚群细胞的移植较CD14-细胞移植,对大鼠肝硬化具有更好的治疗效果。其参与肝损伤修复的机制是促进内援性肝细胞再生、降解细胞外基质。因此,PBSCs中CD14+单核细胞可能是PBSCs移植治疗终末期肝病真正的效益细胞。
【图文】：

骨髓干细胞

细胞、骨骼肌干细胞、肺脏上皮干细胞和胃肠道上皮干细胞等[6]（见表中，骨髓来源的干细胞，是迄今研究最多、认识最深刻的成体干细床研究表明，骨髓干细胞在人类疾病的干细胞治疗中具有重要的临价值。、骨髓干细胞的分类及特征骨髓干细胞根据细胞功能的不同可分为：造血干细胞（Hematopom cells, HSCs）、间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）和细胞（Endothelial progenitor cells, EPCs）。另外，，根据分离方法的不生出其它三种干细胞：分别命名为多能成体祖细胞(Multipotent ogenitor cells, MAPCs)、多能干细胞(Pluripotent stem cells, PSCsCR4+（CXC chemokine receptor 4）组织定向性干细胞（Tissue commm cells, TCSCs)[7]（见图 1）。

骨髓干细胞,可塑性

骨髓基质细胞为滋养细胞，支持HSCs生长。近年来研究显示，骨髓干细胞可跨系甚至跨胚层分化成在与造血系统完全无关的多种组织细胞类型，如神经、肌肉、血管内皮、心、肝、肾和胰腺等细胞（见图2）。骨髓干细胞这种跨系、跨胚层分化的特性称为骨髓干细胞的可塑性，也称为横向分化或转分化[24]。在胚胎发育时期，胚胎的内、中、外三个胚层可分化、发育为机体的所有组织器官。其中，外胚层来源的组织主要包括神经组织、皮肤、牙釉质、角膜上皮、晶状体、内耳膜迷路、口腔和鼻腔等；中胚层来源的组织主要包括骨头、结缔组织、血管和肌肉等；中胚层来源的组织主要包括消化道、呼吸道、肺脏、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、膀胱和阴道等多种来源的上皮组织。图 2、骨髓干细胞的可塑性[24]1995年，Wakitani等[25]率先发现MSCs在体外可诱导分化成心肌样细胞。相关博士学位论文 2011年第12期医药卫生科技辑 E064-13-16
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.3

【相似文献】