Claudin7丝氨酸磷酸化对结肠上皮细胞屏障的影响以及TRPV4对其调节作用的实验研究

发布时间：2020-05-04 20:23

【摘要】：背景:结肠上皮细胞屏障受损是溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)发病的重要环节,紧密连接(tight junction,TJ)是构成结肠上皮的重要结构,其中紧密连接蛋白Claudin7作用显著。有文献报道,紧密连接蛋白异常磷酸化会改变Claudin之间的连接方式,导致上皮细胞间通透性发生改变,是影响上皮细胞屏障的重要因素。TRPV4是瞬时受体电位超家族(transient receptor potential vanilloid,TRPV)中重要成员之一,TRPV4被激活后可引起细胞内TRPV4通道的开放导致胞浆内Ca2+浓度明显升高,激活钙调激酶,影响Claudin的丝氨酸磷酸化。目的:探讨Claudin7丝氨酸磷酸化对结肠上皮屏障功能的影响;阐明TRPV4通道对Claudin7丝氨酸磷酸化修饰的调节作用。方法:收取人的结肠癌癌旁组织、溃疡性结肠炎结肠组织和结肠上皮细胞的蛋白,用蛋白免疫印迹方法检测TRPV4的表达;用免疫共沉淀的方法检测TRPV4和Claudin-7之间的相互作用;利用PCR技术获得Claudin-7丝氨酸磷酸化突变体,分子重组技术获得重组载体,通过嘌呤霉素筛选建立稳转细胞株,将各组细胞命名为Vector,Cld7-wild,Cld7-m S204,Cld7-m S206,Cld7-m S207;利用共聚焦显微镜观察稳转细胞荧光表达,确定Claudin-7蛋白的定位;利用电阻仪检测稳转细胞单层在使用TRPV4激动剂或阻断剂后各组细胞的跨膜阻抗;利用细胞划痕实验检测各组细胞在TRPV4激动剂或阻断剂刺激后的迁移能力。结果:(1)组织中,溃疡性结肠炎患者结肠粘膜组织与正常组相比TRPV4表达升高。细胞中,Cld7-m S204组与Vector组相比TRPV4表达降低,Cld7-m S204组、Cld7-m S207组与Cld7-m S206组相比TRPV4的表达降低;(2)与Vector组相比,Cld7-m S204组细胞单层对FD20的通透性降低,Cld7-m S206和Cld7-m S207组的通透性升高。TRPV4激动剂刺激后,Vector、Cld7-wild、Cld7-m S206和Cld7-m S207组单层细胞对FD20的通透性明显升高,而预孵育TRPV4阻断剂10min后加入TRPV4激动剂,各组细胞单层对FD20的通透性与仅有激动剂刺激相比降低。Cld7-m S204组细胞单层在两种药物处理下对FD20的通透性没有区别;(3)与Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206组相比,Cld7-m S204和Cld7-m S207组细胞单层的跨膜阻抗升高。Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206组细胞单层的跨膜阻抗在使用阻断剂预10min后再加入激动剂与仅有激动剂刺激相比有所升高。两种药物处理方式对Cld7-m S204和Cld7-m S207组细胞单层跨膜阻抗的影响没有明显差异;(4)Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206组单层细胞在TRPV4激动剂和阻断剂的共同干预下,其迁移速率与仅有激动剂刺激相比都明显降低。两种药物处理方式对Cld7-m S204和Cld7-m S207组单层细胞的迁移率的影响无明显差异。结论:在人结肠上皮细胞中,Claudin-7的204位点丝氨酸磷酸化增加上皮屏障的通透性;在人结肠上皮细胞中,TRPV4蛋白通过对Claudin-7的204和207位点丝氨酸磷酸化的调节改变Claudin-7的丝氨酸磷酸化水平,影响上皮屏障通透性以及细胞的迁移。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62

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