骨形态发生蛋白-4在Barrett食管发生中的作用及机制研究

发布时间：2020-05-05 00:05

【摘要】： 背景和目的: Barrett食管(BE)指食管下段鳞状上皮细胞被柱状上皮细胞替代。大多数食管腺癌发生在BE基础上,而后者被认定为胃食管反流病(GERD)的并发症。新近观点认为胃酸与胆盐是诱发具有遗传倾向患者发生BE的环境因素,二者均可直接损伤食管粘膜上皮诱发BE发生,但具体分子发生机制尚不明确。最近的研究发现TGF-β家族中的BMP4可能参与这个过程,相对于正常食管粘膜,BMP4在食管炎与Barrett食管粘膜中的表达明显上调,并可以诱导正常食管鳞状上皮细胞细胞角蛋白表达发生变化。实验证明BMP4具有广泛的作用,如诱导成骨、维持胚胎正常发育、诱导干细胞分化等等,但在BE表达上调的机制及意义尚不清楚。为此本课题的研究目的是研究酸与胆盐对于正常食管鳞状上皮细胞BMP4表达的影响,并探讨在食管上皮肠化生过程中BMP4所发挥的作用及相关机制。方法: 1.通过内镜检查下取材、改良消化酶、应用完全KSFM培养基探索简便易行的体外培养食管鳞状上皮细胞(EECs)的方法;2.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,研究酸与胆盐对EECs BMP4基因和蛋白表达的影响;3.采用细胞计数、Am-Blue法检测重组人BMP4(rhBMP4)对于EECs增殖与活力的影响;4.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,检测rhBMP4诱导的EECs Villin、CDX2 mRNA与蛋白合成的变化,以及BMP4特异性拮抗剂Noggin对于酸诱导EECs表达Villin蛋白效应的影响,以明确BMP4诱导食管上皮肠化生的作用;5.采用Western blot的方法,检测rhBMP4对EECs Smad1活化水平和ID2蛋白表达水平的影响,以研究BMP信号通路在BMP4诱导肠化生中的作用。结果: 1.内镜下取材方法简便,并可获得足够活细胞。TrypLETM Express较胰酶纯度高,对细胞损伤小。原代培养EECs以基底层细胞为主,混以少量分化层细胞,无成纤维细胞污染。长期传代培养细胞仍保持良好形态与增殖能力。 2.正常EECs未检测到BMP4 mRNA和蛋白表达。酸呈浓度与时间依赖性刺激BMP4 mRNA和蛋白表达,pH4.0效应最强并与pH7.2存在显著性差异(P0.05)。混合结合胆盐在pH7.2条件下轻度刺激BMP4表达(P0.05),在pH4.0条件下效应明显增强(P0.05)。 3.rhBMP4呈浓度依赖抑制EECs增殖(P0.05)、降低细胞活力(P0.05),可能与BMP4促细胞凋亡有关。 4.正常EECs不表达肠化上皮标志物Villin、CDX2蛋白, rhBMP4可呈浓度依赖性促进细胞表达这两种蛋白(P0.05)。 5.慢性酸暴露可明显上调EECs Villin表达(P0.05),BMP4特异性拮抗剂Noggin可有效抑制这种效应(P0.05)。相对而言,短暂酸暴露对于Villin表达无影响。 6.rhBMP4可迅速活化EECs内Smad1(P0.05),并呈时间依赖性增强ID2蛋白表达(P0.05)。但撤去rhBMP4 10分钟后P-Smad1水平恢复正常。结论: 1.采用内镜下取材、改良消化方法、应用完全K-SFM培养基可成功进行人EECs的原代和传代培养,并克服了传统方法中所存在的细胞来源受限、易受成纤维细胞污染、细胞数量稀少、细胞传代困难等问题。 2.胃酸从基因转录及蛋白合成水平上刺激EECs表达BMP4,并呈时间与浓度依赖性。单独胆盐的作用较弱,在胃酸存在条件下作用增强。提示胃酸可能是导致Barrett食管发生最重要的环境因素,而胆盐则可能起到协同效应。 3.BMP4可抑制EECs增殖,促进EECs表达肠化上皮标志物Villin和CDX2。而BMP4拮抗剂Noggin可有效抑制酸诱发的EECs表达Villin蛋白。提示BMP4上调可能是食管上皮肠化生过程中的关键点。 4.BMP4可有效激活EECs内Smad1,并促进ID2蛋白表达,提示BMP4通过激活胞内的BMP通路参与BE的发生。
【图文】：

形态图,原代培养,相差显微镜,形态

约10 d后细胞开始融合成片，需要传代。前5-6代细胞大小形态均一，，之后出现逐渐增多的巨形细胞，胞浆内颗粒也随之增多，第10代细胞仍保持良好形态与增殖能力，之后未再继续传代。见图1。2．生长曲线：以1×104/ml接种于10ml培养瓶中，细胞群体倍增时间（DT）为(47.4± 2.8) h (n=3)。

培养细胞

多数培养细胞表现为CK14阳性染色
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R571;R735.1

【参考文献】