肝星状细胞干细胞特性的初步研究

发布时间：2020-05-07 06:19

【摘要】：终末期肝病(End-stage liver disease，ELD)是各种急性或慢性肝脏疾病逐步发展的最后共同阶段。肝星状细胞在各种肝脏疾病的发生发展过程中起重要的作用，它是肝脏细胞外基质(Extracellular Matrix，ECM)的主要合成细胞，亦是肝纤维化发生的核心细胞，它的激活及转化是肝纤维化发生的前提。目前，关于终末期肝病的治疗手段非常有限，最佳选择是肝脏移植。但是该方法受限于临床供体短缺，手术费用高昂以及移植术后严重的排斥反应，因此我们迫切需要一种新的治疗方法治疗终末期肝病并改善患者的生存质量。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。我们根据干细胞的来源将其分为胚胎干细胞和成体干细胞。肝脏干细胞属于成体干细胞中一类，进一步分为肝源性干细胞主要为卵圆细胞，，非肝源性干细胞包括骨髓造血干细胞以及间充质干细胞等。近年来，干细胞移植治疗各种急慢性肝病已取得初步成果，但其利弊仍处于不断的争论之中。肝星状细胞是存在于肝内Disse间隙的一类具有重要生理病理意义的肝脏间质细胞。既往研究发现各种肝脏的急慢性病变都可促使其活化，形成肌纤维母细胞，分泌大量胶原蛋白和细胞外基质，影响肝脏正常的机能和代谢以及形态学上的变化。目前，文献报道关于肝星状细胞更多的生物学功能和胚胎来源尚不十分清楚，存在争议。我们的前期实验发现肝星状细胞表达某些干细胞标记物。由此，我们设想肝星状细胞是否具有一定潜在干细胞特性？其是否为肝内的一类未完全分化的干/祖细胞群体，能否在某些条件下向肝内实质细胞分化？是否可对肝星状细胞活化进行干预，从而促使其参与肝细胞损伤后修复，而少发挥或不发挥促进肝纤维化和肝硬化的形成的作用。因此，本课题分以下几个部分：1.肝星状细胞的分离提取及鉴定。获得原代大鼠肝星状细胞并对提取细胞进行特异性鉴定。2.肝星状细胞干细胞标记物的检测。通过肝星状细胞可能的胚胎来源，进行不同的干细胞标记物筛选检测。3.肝星状细胞体外诱导向肝细胞样细胞分化的研究。通过建立体外诱导肝星状细胞分化的培养体系，观察原代肝星状细胞通过多种细胞因子联合诱导是否能定向向肝细胞样细胞分化。通过上述研究，旨在说明：1.原代肝星状细胞表达某些干细胞标记物。2.肝星状细胞可通过体外诱导定向分化为肝细胞样细胞。初步证明肝星状细胞具有一定潜在的干细胞特性，其可能是肝内的干/祖细胞群体。方法 1.原代大鼠肝星状细胞的分离提取取重约450-520g SD大鼠，分别采用原位肝灌注联合离体肝灌注法和原位肝灌注法分离大鼠肝脏细胞，再采用60%Percoll通过密度梯度离心提取目的细胞。 2.原代大鼠肝星状细胞鉴定包括肝星状细胞形态学鉴定，肝星状细胞480nm激光下自发荧光鉴定，肝星状细胞脂滴鉴定以及细胞特异性标记物鉴定等。 3.检测原代肝星状细胞干细胞标记物的表达包括RT-PCR鉴定肝星状细胞干细胞标记物mRNA水平的表达，细胞免疫荧光鉴定肝星状细胞干细胞标记物蛋白水平的表达。 4.多种细胞因子诱导原代大鼠肝星状细胞向肝细胞样细胞分化根据实验分为二组，原代不加任何细胞因子培养24h的HSC为对照组，用bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等细胞因子诱导3天，然后用含FGF420ug/L培养基诱导4d的HSC为实验组。 5. Realtime PCR和ICC检测诱导前后肝星状细胞表达肝细胞特异性基因和蛋白。 6. Realtime PCR和ICC检测诱导前后肝星状细胞干细胞标记物mRNA和蛋白水平表达及变化。结果 1.采用原位肝灌注联合60%Percoll密度梯度离心法获得的肝星状细胞数量较多，达1.8×107/只大鼠，细胞活力≥90%。 2.提取的目的细胞最初为类圆形贴壁，培养7天后呈典型的肝星状细胞形态，倒置显微镜下可见丰富脂滴呈“花环状”围绕核周，328nm激光下可见明显的绿色荧光，尼罗红脂滴染色呈阳性，特异性标记物Desmin和GFAP细胞免疫荧光染色均阳性，细胞纯度≥95%。 3.原代肝星状细胞表达P75NTR、CD90、CD105、Dlk-1、c-kit、CD133、sox2、nanog、oct-4、lgr5等干细胞标记物基因,并表达P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干细胞标记物蛋白。 4.原代肝星状细胞经过bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等细胞因子诱导后，与诱导前相比较，细胞形态呈肝细胞样细胞为类圆形或多角形。 5.原代肝星状细胞经过bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等细胞因子诱导后，与诱导前相比较，转录水平出现肝细胞特异性标记物ALB的表达(P＜0.01)和AFP的表达(P＜0.05)，细胞免疫荧光检测蛋白水平变化与mRNA水平一致。 6.原代肝星状细胞经过bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等细胞因子诱导后，与诱导前相比较，肝星状细胞干细胞标记物P75NTR转录水平表达下降(P＜0.05)，CD90、c-kit、sox-2、oct-4等转录水平表达显著下降(P＜0.01)，细胞免疫荧光检测诱导前后干细胞标记物蛋白水平明显下降与基因水平表达一致。结论 1.本研究方法可获得较高数量和质量的原代大鼠肝星状细胞。 2.原代肝星状细胞在mRNA水平和蛋白水平表达P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干细胞标记物，提示其可能具有某些潜在的干细胞特性。 3.原代肝星状细胞经过体外多种细胞因子诱导可向肝细胞样细胞分化，并表达肝细胞特异性标记物AFP、ALB基因和蛋白。 4.原代肝星状细胞经过体外多种细胞因子诱导向肝细胞样细胞分化过程中，伴有干细胞标记物的表达下降，初步说明肝星状细胞可能具有潜在干细胞分化特性，可能是肝内一类具有分化潜能的干/祖细胞群。 5.本研究提供了一种短期内利用bFGF、FGF4、HGF和IL-6等细胞因子联合诱导肝星状细胞向肝细胞样细胞分化的培养方法，为后续研究其作用机制奠定了基础。 6. P75NTR、CD90、c-kit、sox2、oct-4等干细胞标记物可能为今后筛选具有干细胞特性的肝星状细胞群体提供参考，为肝星状细胞干细胞特性深入研究奠定基础。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575

【参考文献】