过氧化物霉体增殖物激活受体α调控治疗酒精性肝病的作用机制研究

发布时间：2020-05-09 21:07

【摘要】：酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）为影响人们健康的主要肝脏疾病之一。ALD包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化一系列病理改变。90%长期过量饮酒者可发生脂肪肝，30-37%可进展为酒精性肝纤维化及肝硬化，并有5-15%患者即使戒酒仍可发生酒精性肝纤维化及肝硬化，此可能与酒精导致的过度脂肪堆积引发氧化应激反应导致肝细胞凋亡及炎症、纤维化有关。至今酒精性肝炎、肝纤维化发病的分子生物机制尚未完全阐明，因此，建立与人类比拟性好的进展性ALD动物模型并探明其发病机制、进一步明确关键基因调控对该病的治疗作用将为ALD的防治开拓新思路。过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator activatedreceptor alpha，PPARα）是调节脂质代谢的关键核转录因子，可通过调控肝内脂肪酸合成、氧化及转运相关基因表达，纠正肝脏脂质代谢紊乱，减少肝组织脂质沉积，并减轻氧化应激反应，抑制炎症因子及促纤维化因子产生和释放，阻止/减轻肝组织损伤，靶向调控PPARα有望成为治疗ALD的有效措施。本研究采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养C57BL/6J小鼠建立酒精性肝炎模型，应用酒精液体饲料喂养联合微量四氯化碳腹腔注射建立酒精性肝纤维化模型。旨在揭示酒精性肝损伤发生机制，并阐明PPARα在酒精性肝炎/肝纤维化进展中的作用及分子机制，为临床有效防治ALD提供新的作用靶点和理论依据。第一部分酒精性肝炎/肝纤维化动物模型的建立及肝组织PPARα表达与作用的研究目的：建立酒精性肝炎、肝纤维化动物模型，探讨肝组织PPARα在酒精性肝炎、肝纤维化发病中的表达变化及其作用。方法：选用健康雄性C57BL/6J小鼠，采用含4%酒精的Lieber-DeCarli液体饲料喂养12周建立酒精性肝炎模型，以不含酒精对照液体饲料喂养小鼠作为对照组；采用Lieber-DeCarli液体饲料喂养小鼠4周后联合微量四氯化碳腹腔注射至8周建立进展性酒精性肝纤维化模型，于造模第0、4、5、6、7、8周各处死6只小鼠，设立对照组、四氯化碳组、酒精组及溶剂对照组，于造模第8周处死各组小鼠。酶法检测血清丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotransferase， ALT）及天门冬氨酸氨基转移酶（aspartateaminotransferase，AST）水平；苏木素-伊红（Haematoxylin and eosin，HE）染色及Masson染色观察肝组织脂肪变性、炎症及纤维化程度；透射电镜分析观察肝细胞超微结构改变；免疫组织化学染色观察肝组织α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表达变化；实时荧光定量PCR及Western blot检测肝组织PPARα mRNA及蛋白表达变化。结果：含4%酒精Lieber-DeCarli液体饲料喂养小鼠12周可成功建立酒精性肝炎模型；Lieber-DeCarli液体饲料喂养4周后联合微量四氯化碳腹腔注射至8周可快速建立酒精性肝纤维化模型。 1酒精性肝炎模型血清生化学、肝组织病理学特点及PPARα表达变化 1.1实验小鼠血清ALT及AST水平：酒精组小鼠血清ALT（150.33±20.68vs58.83±15.79U/L，P 0.001）及AST（259.67±28.13vs105.17±13.83U/L，P 0.001）水平较对照组小鼠显著升高。 1.2实验小鼠肝组织病理学表现：对照组小鼠肝小叶结构正常；酒精组小鼠肝组织可见肝细胞气球样变、脂肪变性，小叶内可见少量点状肝细胞坏死，伴有少量单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞浸润。 1.3实验小鼠肝细胞超微结构变化：对照组小鼠肝细胞内细胞器含量丰富，可见大量线粒体、内质网、核糖体等。酒精组小鼠肝细胞内可见大小不等的脂滴，核周附近细胞内线粒体大部分嵴和部分膜融合，模糊不清，粗面内质网有明显颗粒融合或脱颗粒现象，游离核糖体数量减少。 1.4实验小鼠肝组织PPARα表达变化：酒精组小鼠肝组织PPARα mRNA（0.72±0.03vs0.97±0.07，P 0.05）及蛋白（0.48±0.12vs0.83±0.13，P 0.05）表达均较对照组小鼠减少。 2酒精性肝纤维化模型血清生化学、肝组织病理学特点及PPARα表达变化 2.1实验小鼠血清ALT及AST水平：四氯化碳组（107.00±20.77U/L，P 0.01）及酒精组（76.00±5.76U/L，P 0.05）小鼠ALT水平较对照组（63.50±7.82U/L）升高，酒精组AST水平较对照组升高（300.50±34.16vs103.17±16.15U/L，P 0.01）。酒精+四氯化碳组小鼠血清ALT（1072.50±109.19U/L）及AST（838.17±153.73U/L）水平显著高于其它各组（P 0.01）。酒精+四氯化碳组小鼠血清ALT及AST水平随时间呈逐渐升高趋势，0、4、5、6、7、8周ALT水平依次为73.00±10.33、66.83±6.27、159.90±19.75、199.00±17.60、176.17±15.63及1072.50±109.19U/L，AST水平依次为98.17±12.62、252.50±23.84、480.00±17.40、544.50±72.88、491.67±13.94及838.17±153.73U/L。 2.2实验小鼠肝组织病理学表现：造模8周，对照组小鼠肝小叶结构正常。四氯化碳组小鼠肝组织病变轻微，可见少量炎性细胞浸润，窦周及汇管区可见少量纤维组织沉积。酒精组及溶剂对照组小鼠肝组织病变以肝细胞脂肪变性为主，可见少量炎细胞浸润。酒精+四氯化碳组小鼠造模第4周时主要表现为轻-中度肝脂肪变性，第5周出现炎细胞浸润，窦周出现纤维组织沉积，第6-7周肝小叶内可见点、灶状肝细胞坏死，炎细胞浸润、窦周纤维组织沉积呈进行性加重，第8周可见肝细胞片状坏死，大量炎细胞浸润，桥接纤维化形成。 2.3实验小鼠肝组织α-SMA表达：对照组、四氯化碳组、酒精组及溶剂对照组小鼠肝组织表达少量α-SMA。酒精+四氯化碳组小鼠肝组织α-SMA表达自第5周起进行性增加，主要表达于窦周活化肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）及纤维组织沉积区域。 2.4实验小鼠肝组织PPARα表达四氯化碳组小鼠肝组织PPARα mRNA水平（P 0.01）、酒精组小鼠肝组织PPARα mRNA及蛋白水平（P 0.05及P 0.01）较对照组小鼠降低。酒精+四氯化碳组小鼠PPARα mRNA及蛋白水平较四氯化碳组（P 0.01，P 0.01）及酒精组（P 0.01，P 0.05）小鼠进一步降低。结论： 1含4%酒精Lieber-DeCarli液体饲料喂养12周可成功建立小鼠酒精性肝炎模型，Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养4周联合微量四氯化碳腹腔注射至8周可快速建立小鼠酒精性肝纤维化模型，血清生化学、肝组织病理学改变符合酒精性肝炎、肝纤维化病变特点，模型稳定性好，成功率高；2随着酒精性肝炎、肝纤维化发病与进展，肝组织PPARα表达减少，并与肝损伤程度有关。第二部分PPARα调控对小鼠酒精性肝炎的治疗作用及其机制研究目的：探明PPARα活性调节对小鼠酒精性肝炎的治疗作用及其关键信号通路。方法：Lieber-DeCarli酒精液体饲料喂养C57BL/6J小鼠12周建立酒精性肝炎模型，造模最后2周应用PPARα激动剂WY14643及抑制剂GW6471进行干预实验。酶法检测小鼠血清ALT和AST水平；HE染色观察肝组织脂肪变性及炎症程度；透射电镜分析观察肝细胞超微结构改变；实时荧光定量PCR和Western blot法检测PPARα、PPARα靶基因细胞色素P4504A10（cytochrome P4504A10，CYP4A10）、CYP4A14、脂质代谢相关基因成纤维生长因子21（fibroblast growth factor21，FGF21）、沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1（Sirtuin1，SIRT1）、PPARγ辅激活子1α（PPARγcoactivator-1α，PGC-1α）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS）、促炎因子磷脂酰肌醇(-3)激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、抗炎因子脂联素及血红素氧合酶-1（heme oxygeanse-1，HO-1）表达变化。结果：PPARα激动剂可明显减轻酒精导致的肝脂肪变性及炎症反应。 1实验小鼠血清ALT及AST水平：对照组及酒精组小鼠血清ALT及AST水平同第1部分。激动剂组小鼠ALT（84.00±25.81U/L）及AST（180.33±16.48U/L）水平较酒精组显著降低（P 0.001）。抑制剂组小鼠ALT水平（186.00±20.86U/L）较酒精组进一步升高（P 0.05），AST水平（282.17±25.09U/L）与酒精组无差异。 2实验小鼠肝组织病理学表现： PPARα激动剂可明显减轻酒精喂养小鼠肝组织损伤，肝细胞轻度气球样变，轻度脂肪变性，未见明显肝细胞坏死及炎性细胞浸润。 3实验小鼠肝细胞超微结构变化： PPARα激动剂可明显改善酒精喂养小鼠肝细胞超微结构损伤，肝细胞内脂滴明显减少，线粒体、粗面内质网及游离核糖体未见明显损伤。 4实验小鼠肝组织PPARα及靶基因表达：对照组及酒精组小鼠肝组织PPARα mRNA及蛋白表达水平同第1部分。酒精组CYP4A10及CYP4A14mRNA表达均较对照组小鼠减少。激动剂组小鼠PPARα mRNA及蛋白表达、CYP4A10及CYP4A14mRNA表达较酒精组增加（P 0.05）。抑制剂组小鼠PPARα及CYP4A14mRNA表达较酒精组进一步减少（P 0.05）。 5实验小鼠肝组织脂质代谢相关基因表达：酒精组小鼠肝组织SIRT1mRNA及蛋白、PGC-1α蛋白表达较对照组减少（P 0.01），FAS mRNA及蛋白表达较对照组小鼠增加（P 0.001）。激动剂组小鼠肝组织FGF21、SIRT1及PGC-1α mRNA及蛋白表达较酒精组增多（P 0.05），FAS mRNA及蛋白表达较酒精组减少（P 0.05）。抑制剂组FGF21mRNA及蛋白表达较酒精组减少（P 0.05），FAS mRNA表达较酒精组进一步增多（P 0.01）。 6实验小鼠肝组织炎症因子表达：酒精组小鼠肝组织促炎因子PI3K mRNA、OPN及COX-2mRNA及蛋白表达较对照组增多（P 0.01），抗炎因子脂联素mRNA及蛋白表达减少（P 0.001）。激动剂组小鼠肝组织PI3K、OPN及COX-2mRNA及蛋白表达较酒精组显著下调（P 0.05），脂联素及HO-1表达显著上调（P0.01）。抑制剂组小鼠PI3K蛋白及COX-2mRNA表达较酒精组进一步增多（P 0.05）。结论： 1PPARα激动剂可显著减轻酒精喂养小鼠肝脂肪变及炎症反应，改善肝细胞超微结构损伤，PPARα抑制剂则加重肝损伤； 2PPARα激活可通过上调肝组织促脂肪酸氧化基因表达、下调促脂质合成基因表达，阻止酒精导致的脂质代谢紊乱，减轻肝细胞脂肪累积； 3PPARα激活可抑制肝组织促炎因子表达，促进抗炎因子表达，减轻肝脏炎症反应。第三部分PPARα调控对小鼠酒精性肝纤维化的治疗作用及其机制研究目的：明确PPARα基因调控对酒精性肝纤维化的治疗作用；通过对肝组织炎症及纤维化相关基因表达变化的研究，进一步阐明酒精性肝纤维化发病分子机制以及PPARα治疗酒精性肝纤维化的主要分子机制。方法：选用C57BL/6J小鼠，以酒精液体饲料喂养联合微量四氯化碳腹腔注射建立酒精性肝纤维化模型，造模最后2周应用PPARα激动剂WY14643及抑制剂GW6471进行干预实验。采用酶法检测小鼠血清ALT和AST水平；HE及Masson染色观察肝脂肪变性、炎症及纤维化程度；免疫组织化学染色观察肝组织α-SMA表达变化；实时荧光定量PCR和Westernblot方法检测PPARα、炎症因子肿瘤坏死因子alpha （tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α）、白细胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、促纤维化因子OPN、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、内脏脂肪素、PI3K、基质金属蛋白酶-（2matrix metallopeptidase-2，MMP-2）、MMP-9及抗纤维化因子脂联素及HO-1表达变化。结果：PPARα激动剂可明显减轻酒精及四氯化碳联合作用导致的肝脏炎症及纤维化程度。 1实验小鼠血清ALT及AST水平：对照组、四氯化碳组、酒精组及酒精+四氯化碳组小鼠血清ALT及AST水平同第1部分。激动剂组小鼠ALT（131.17±48.11U/L）及AST（202.83±31.73U/L）水平较酒精+四氯化碳组显著降低（P 0.01）。抑制剂组AST水平（1000.33±85.54U/L）较酒精+四氯化碳组进一步升高（P0.05）。 2实验小鼠肝组织病理学表现： PPARα激动剂可显著减轻酒精与四氯化碳联合处理小鼠肝组织炎症及纤维化程度，肝小叶内少量炎细胞浸润，窦周及汇管区少量纤维组织沉积。 3实验小鼠肝组织α-SMA表达：激动剂组小鼠肝组织α-SMA表达较酒精+四氯化碳组显著减少，仅在中央静脉、汇管区血管及少量纤维组织沉积区域可见。 4实验小鼠肝组织PPARα表达：对照组、四氯化碳组、酒精组及酒精+四氯化碳组小鼠肝组织PPARαmRNA及蛋白表达水平同第1部分。激动剂组PPARα mRNA及蛋白表达较酒精+四氯化碳组小鼠显著增多（P 0.01），而抑制剂组PPARα mRNA表达较酒精+四氯化碳组进一步减少（P 0.01）。 5实验小鼠肝组织炎症因子表达：四氯化碳组及酒精组小鼠肝组织促炎因子TNF-α mRNA表达水平（P0.01）较对照组升高，抗炎因子IL-10mRNA表达水平降低（P 0.01）。酒精+四氯化碳组TNF-α水平可较四氯化碳组及酒精组进一步升高（P 0.01）、IL-10mRNA表达水平进一步降低（P 0.01）。激动剂组TNF-αmRNA表达较酒精+四氯化碳组减少（P 0.01），IL-10mRNA表达较酒精+四氯化碳组增多（P 0.01）。 6实验小鼠肝组织促纤维化因子表达：与对照组比较，四氯化碳组小鼠肝组织OPN、内脏脂肪素、MMP-2mRNA及蛋白表达均增强（P 0.05），TGF-β1及PI3KmRNA表达上调（P0.01），MMP-9蛋白表达增加（P 0.01）。酒精组小鼠肝组织OPN、TGF-β1、内脏脂肪素、PI3K mRNA及蛋白表达均较对照组增多（P 0.05），MMP-2mRNA及MMP-9蛋白表达增多（P 0.05）。酒精+四氯化碳组OPN、TGF-β1、内脏脂肪素、PI3K、MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表达较四氯化碳组进一步增多（P 0.05），而TGF-β1、内脏脂肪素、PI3K、MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白表达较酒精组增多（P 0.05），，OPN mRNA表达较酒精组增多（P 0.01）。激动剂组OPN、TGF-β1、内脏脂肪素、PI3K、MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表达较酒精+四氯化碳组显著减少（P 0.01）。 7实验小鼠肝组织抗纤维化因子表达：与对照组小鼠比较，四氯化碳组小鼠肝组织脂联素mRNA及蛋白表达水平降低（P 0.01），HO-1表达水平升高（P 0.05）。酒精组小鼠肝组织脂联素（P 0.01及P 0.001）表达水平较对照组降低，HO-1（P 0.01及P 0.05）表达水平升高。酒精+四氯化碳组脂联素mRNA及蛋白表达较四氯化碳组及酒精组进一步减少（P 0.05），HO-1表达较四氯化碳组增多（P 0.05），蛋白表达较酒精组增多（P 0.05）。激动剂组脂联素及HO-1mRNA及蛋白表达较酒精+四氯化碳组显著增多（P 0.01），而抑制剂组脂联素及HO-1mRNA表达较酒精+四氯化碳组减少（P 0.05）。结论： 1在酒精及微量四氯化碳联合作用下，肝组织促炎、促纤维化因子表达上调，抗炎、抗纤维化因子表达下调，激活HSC，导致肝纤维化发生并进展；2PPARα激动剂下调促炎、促纤维化因子表达，上调抗炎、抗纤维化因子表达，减轻肝组织损伤，阻止HSC活化，显著减轻酒精性肝纤维化。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575

【参考文献】