肿瘤坏死因子alpha增加肠上皮细胞屏障通透性的机制研究

发布时间：2020-05-26 08:17

【摘要】： 肿瘤坏死因alpha增加肠上皮细胞屏障通透性的机制研究 目的 肠黏膜屏障是机体最重要的免疫防御屏障，将机体与肠道内的外源性物质隔离开来，避免病原微生物的侵袭和抗原分子的损伤。肠黏膜屏障包括肠上皮细胞屏障、免疫屏障和微生物屏障，肠上皮细胞屏障是最重要的一道屏障，是肠黏膜屏障具有选择性通透的基础。目前研究发现肠上皮细胞屏障通透性增高参与多种疾病的发生(如炎症性肠病、败血症、烧伤、终末期肝病、重症胰腺炎等)，并且在这些情况下，血清肿瘤坏死因子alpha(TNFα)明显升高，与肠上皮细胞屏障的损害程度呈正相关，抗TNFα抗体可以恢复受损的肠上皮细胞屏障。因此认为TNFα是增加肠上皮细胞屏障通透性的重要因素。 虽然目前已经形成共识：TNFα可以增加肠上皮细胞屏障的通透性，但TNFα的具体作用机制和方式还存在争议。早期认为与TNFα引起的细胞凋亡密切相关，近年来则倾向于TNFα引起肠上皮细胞屏障损伤是凋亡非依赖性的。另外TNFα引起肠上皮细胞屏障通透性增高的具体作用环节也不十分清楚，可能与蛋白激酶C(PKC)、核因子kB(NF-kappaB)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)、丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等信号途径有关。因此我们应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型，观察TNFα对肠上皮细胞屏障通透性和肠上皮细胞间紧密连接的影响，并在此基础上探讨了TNFα对调控紧密连接装配的蛋白酶活化受体-3／非典型蛋白激酶C／蛋白酶活化受体-6(Par-3／aPKC／Par-6)复合体的影响和可能信号通路，以明确病理条件下，TNFα增加肠上皮细胞屏障通透性的作用机制。 材料和方法 1、体外肠上皮细胞屏障模型的建立 应用Caco-2细胞株建立体外肠上皮细胞屏障模型，并应用跨上皮细胞电阻(TEER)和荧光黄透过率两种指标检测肠上皮细胞屏障的形成情况。 2、TNFα对肠上皮细胞屏障通透性的影响 加入不同浓度的TNFα(10μ／L或100μg／L)作用24h或加入TNFα100pg／L作用不同时间(2、4、8、24h)，观察加入TNFα前后Caco-2细胞屏障跨上皮细胞电阻的改变及TNFα对Caco-2细胞荧光黄透过率的影响。 3、TNFα对肠上皮细胞间紧密连接的影响 透射电镜下观察加入TNFα100μtg／L作用24h后，Caco-2细胞间紧密连接形态学的改变。 4、TNFα对肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin定位和表达的影响 制备Caco-2细胞NP-40可溶性和NP-40不溶性蛋白框架，应用蛋白印迹杂交(Western blot)技术，检测加入不同浓度的TNFα(10μg／L或100μg／L)作用24h后，不同蛋白框架内肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin表达的变化情况。并应用免疫荧光和实时定量PCR技术检测occludin蛋白的定位和mRNA表达的变化情况。 5、TNFα对肠上皮细胞Par-3表达和定位的影响 加入TNFα100μg／L作用不同时间(0、4、8、24h)后，应用免疫荧光、Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测TNFα对肠上皮细胞Par-3表达和定位的影响。 6、TNFα对肠上皮细胞非典型蛋白激酶C亚型PKλ丸和PKCζ活性的影响 应用抗PKCζ／λ(Thr410／403)磷酸化抗体检测加入TNFα100μg／L作用不同时间(0、4、8、24h)后，PKCλ／ζ(活性的改变。 7、应用免疫共沉淀的方法检测Caco-2细胞内与Pat-3结合的信号分子 应用抗Par-3抗体沉淀Caco-2细胞裂解产物，然后应用抗T淋巴瘤侵袭转移因子(Tiaml)抗体对沉淀产物进行蛋白印迹杂交，明确Par-3是否与Tiaml结合。 8、TNFα对肠上皮细胞T淋巴瘤侵袭转移因子表达和定位的影响 加入TNFα100μg／L作用不同时间(0、4、8、24h)后，应用免疫荧光、免疫电镜、Western blot和RT-PCR技术检测TNFα对肠上皮细胞Tiaml表达和定位的影响。 9、TNFα对肠上皮细胞Racl活性的影响 应用配体免疫沉淀法检测加入TNFα100μg／L作用不同时间(0、4、8、24h)后，Racl活性的改变。 10、Tiaml在TNFα降低紧密连接蛋白occludin表达中的作用 应用小核糖核酸干扰(siRNA)技术沉默Caco-2细胞内Tiaml基因，观察在Tiaml低表达的Caco-2细胞内，TNFα对紧密连接蛋白occludin表达的影响。 结果 1、TNFα增加肠上皮细胞屏障的通透性 与对照组相比，10μg／L TNFα即可降低肠上皮细胞屏障的TEER(P＜0.0005)，增加荧光黄透过率(P＜0.0005)，100μg／L TNFα这种作用更加明显(P＜0.0005)。在作用时间上，TNFα100μg／L作用4h后，TEER值即开始下降(P＜0.0005)，荧光黄透过率开始升高(P=0.001)，24h这种作用达到最强(P＜0.0005)。 2、TNFα破坏肠上皮细胞间的紧密连接 正常CaCo-2细胞，紧密连接结构完整，呈致密的带状结构。加入TNFα100μg／L作用24h后，紧密连接断裂，细胞间隙增宽。 3、TNFα引起肠上皮细胞紧密连接蛋白occludin的定位异常 正常Caco-2细胞，occludin蛋白沿细胞膜分布；加入TNFα10μg／L作用24h后，occludin蛋白呈锯齿状分布，并且荧光信号减弱；加入TNFαt100μg／L作用24h后，锯齿状分布更加明显，荧光信号进一步减弱，并且在胞浆内可见阳性染色。 4、TNFα引起occludin蛋白磷酸化减少 与对照组比较，加入TNFα100μg／L作用24h后，NP-40不溶性蛋白框架内occludin蛋白(即磷酸化occludin蛋白)的相对含量明显减少(P=0.016)，而NP-40可溶性蛋白框架内occludin蛋白(即非磷酸化occludin蛋白)的相对含量没有变化(P=0.99)。 5、TNFα不影响occludin mRNA的表达 与对照组比较，不同浓度的TNFα或TNFα作用不同时间，，均不能引起occludin mRNA的明显改变(P=0.85，P=0.99)。 6、TNFα不影响Par-3的表达和定位 正常Caco-2细胞，Par-3定位在细胞膜上，与紧密连接蛋白的定位一致，加入TNFα不能改变Par-3蛋白的定位。Western blot和RT-PCR结果提示加入TNFα后，Par-3蛋白和mRNA的相对含量与正常对照组比较没有差别(P=0.99，P=0.86)。 7、TNFα下调PKCλ/ζ活性 与正常对照组相比，TNFα100μg/L作用8h后，PKCλ/ζ活性开始下降(P=0.014)，24h达到最低(P=0.001)。 8、Par-3与Tiam1免疫共沉淀 应用抗Tiam1抗体对Par-3预沉淀产物进行蛋白印迹杂交后，发现在170kDa处出现特异性蛋白条带，证明在Caco-2细胞内，Par-3与Tiam1结合。 9、TNFα增加Tiam1表达，促进Tiam1活化 在正常Caco-2细胞，Tiam1分布在胞浆内，加入TNFα100μg/L作用24h后，Tiam1向细胞膜转移。Western blot和RT-PCR结果显示，与正常对照组比较，TNFα100μg/L作用24h后，Tiam1蛋白和mRNA的相对含量明显升高(P=0.029，P=0.011)。 10、TNFα促进Rac1的活化 与正常对照组比较，加入TNFα后，总Rac1的含量没有明显变化(P=0.99)。但活性Rac1(GTP-Rac1)的含量在TNFα100μg/L作用24h后明显升高(P=0.002)。 11、Tiam1介导TNFα引起的紧密连接蛋白occludin磷酸化减少 在Tiam1正常表达的Caco-2细胞，TNFα可以引起occludin蛋白磷酸化的减少，而在Tiam1低表达的Caco-2细胞，TNFα的这种作用消失，两者相比有明显的统计学差异(P=0.001)。 1、TNFα增加肠上皮细胞屏障的通透性。 2、TNFα破坏肠上皮细胞间的紧密连接，这是其增加肠上皮细胞屏障细胞旁通透性的作用位点。 3、TNFα引起紧密连接蛋白occludin的异常分布，使紧密连接蛋白occludin磷酸化减少，但不影响未磷酸化的occludin蛋白表达。 4、TNFα不影响occludin mRNA的表达，提示TNFα对occludin的调节发生在蛋白水平，而不是转录水平。 5、TNFα不影响Par-3的表达和定位，但能使PKCλ／ζ的活性降低，提示TNFα对于调控紧密连接装配的Par-3／aPKC／Par-6复合体的定位没有影响，但能抑制Par-3／aPKC／Par-6复合体的功能。 6、Tiam1-Rac1是Par-3／aPKC／Par-6复合体的上游信号因子。 7、TNFα能够增加Tiam1蛋白和mRNA水平的表达，促进Tiam1和Rac1活化。 8、TNFα引起Caco-2细胞紧密连接蛋白occludin磷酸化减少需要Tiam1的参与。
【图文】：

差异具有统计学意义(尸<0.0005)。提示TNFa可以降低Caco一2细胞的TEER，并具有浓度依赖性(图1左)。TNFa对Caco一2细胞TEER的影响还具有时间依赖性。在加入，I’ NFaloo拼叭作用Zh后，TEER值即有所下降 (115.5士0.6oc时)，但与加入TNFa前比较没有统计学意义(尸一0.85);4h开始TEER值明显下降(65.1士0.5。·emZ)，sh为(45.9士。，4Q·emZ)， 24h达到最低(28.05土o.gQ·emZ)，与加入州Fa前(128.4士1.oocmZ)比较

正常Caco一2细胞对荧光黄的透过率很低(2.23士0.8%)，加入TNFa后，从10林g几开始，荧光黄的透过率即有增加(13.26士1.4%)，与正常对照组比较具有统计学意义(尸<0.0005)，100林留L时更加明显(20.55士3.7%)(p<0.0005)(图2左)。将T’NFal00林g/L与Caco一2细胞作用不同时间后，caco一2细胞对荧光黄的透过率分别为Zh(2.08士0.4%)，4h(5.41士0.7%)，sh(13.1士2.0%)，24h(23.05士1.7%)。从4h开始，Caco一2细胞对荧光黄的透过率开始升高，与正常对照组(2.07士0.2%)比较具有统计学意义(尸=0.001)，8h增高更加明显(尸<0.0005)
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R574

【引证文献】

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1 杨玫;周安国;王之盛;;锌对断奶仔猪肠道屏障的影响[J];中国饲料;2008年21期

本文编号：2681548