高迁移率族蛋白B1在肝纤维化发生发展中的作用及其机制的作用

发布时间：2020-05-26 09:12

【摘要】：目的： 通过观察高迁移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)对肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活,以及RAGE在其激活过程中的作用,探讨HMGB1对HSC的激活作用及其相关机制,为肝硬化的防治提供思路和实验依据。 方法： 第一部分实验：HSC复苏后,加DMEM培养液于37℃、5%CO2孵箱中培养,待铺满80%后用0.25%胰酶消化,传代2次至对数生长期用于实验。调整细胞浓度为2～5×105／ml,转至6孔细胞培养板,每孔1ml培养液,继续培养,细胞单层融合达80%后,换无血清的DMEM培养液孵育2h,使培养细胞均处于G0期用于实验。实验分为三组：第一组：对照组(DMEM培养液1m1)；第二组：HMGB1刺激组(HMGB1 0.1ug/m1)；第三组：HMGB1抗体组(加HMGB1抗体20ug/ml培养2小时后+HMGB1 0.1ug/ml)。培养24小时后,采用免疫组化法检测HSC的α-SMA和TGF-β1的表达,ELISA法检测细胞培养上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的含量。 第二部分实验：复苏后的HSC置于DMEM培养液中,放在37℃、5%C02孵箱中培养,待细胞融合80%后,以0.25%胰蛋白酶消化传代,以传至第二代的细胞用于实验。实验分为三组：第一组：(A)对照组(DMEM培养液1ml)；(B)HMGB1刺激组(HMGB10.1ug／ml)；(C)抗RAGE+HMGB1组(加RAGE抗体20ug／ml 2小时后+HMGB1 0.1ug／ml)；第二组：(A)对照组(DMEM培养液1m1)；(B)HMGB1刺激组(HMGB1 0.1ug/m1)；(C)sRAGE+HMGB1组(sRAGE 20ug／ml和HMGB1 0.1 ug／ml混合2小时后加入细胞DMEM培养液中)；第三组：(A)对照组(DMEM培养液1m1)；(B)HMGB1刺激组(HMGB10.1ug/m1)；(C)AGE+HMGB1组(加AGE160ug/ml 2小时后+HMGB1 0.1ug/m1)。培养24小时后,采用免疫组化法检测HSC中α-SMA和TGF-β1的表达,ELISA检测细胞培养上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量。 结果： 1.HMGB1对HSC有显著的激活作用：免疫细胞化学结果显示,对照组HSC未刺激时α-SMA、TGF-β1在细胞质中微弱表达；HMGB1刺激24h后(1-SMA、TGF-β1较对照组表达明显增加(P0.05)；加入HMGB1抗体后,α-SMA、TGF-β1在细胞质中表达水平与对照组比较无显著差别(P0.05),但较HMGB1组比较显著下降(P0.05)。未刺激时,细胞培养上清液中HA,PIIIP,CIV和TGF-β1含量较少；HMGB1刺激24h后HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量均较对照组明显增加(P0.05)；加入HMGB1抗体后,HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量与对照组无显著差别(P0.05),但较HMGB1组明显下降(P0.05)。 2.RAGE抗体能抑制HMGB1对HSC的激活作用：免疫细胞化学结果显示,在抗RAGE+HMGB1组,HSC细胞质中的α-SMA、TGF-β1表达水平较HMGB1组明显减少(P0.05)；ELISA结果显示,抗RAGE+HMGB1组培养液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量较HMGB1组显著下降(P0.05)；抗RAGE+HMGBI组的免疫细胞化学和ELISA结果虽均较对照组有所增高,但差异无统计学意义(P0.05)。 3.sRAGE可拮抗HMGB1对HSC的激活作用：免疫细胞化学结果显示,在sRAGE+HMGB1组,HSC细胞质中α-SMA、TGF-β1表达水平较HMGB1组明显减少(P0.05)；ELISA结果显示,sRAGE+HMGBI组培养液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量较HMGB1组显著下降(P0.05),sRAGE+HMGBI组的免疫细胞化学和ELISA结果虽均较对照组有所增高,但差异无统计学意义(P0.05)。 4.AGE无阻断HMGB1对HSC的激活作用：免疫组化结果显示,在AGE+HMGB1组HSC细胞质中的α-SMA、TGF-β1表达较HMGB1组比较有所增加,但差异无统计学意义(P0.05)；ELISA结果显示,AGE+HMGB1组培养液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量较HMGB1组比较有所增加,但差异无统计学意义(P0.05)。AGE+HMGBI组的免疫组化和ELISA结果与对照组比,表达水平均明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。 结论： 1.HMGB1可促进α-SMA、TGF-β1在HSC细胞质中的表达,增加HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌,在肝纤维化的发生发展中发挥重要作用； 2.RAGE抗体和sRAGE能抑制HMGB1对HSC的激活作用,能减少α-SMA、TGF-β1在HSC细胞质中的表达,降低HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌,在一定程度上缓解肝纤维化的发展；虽然AGE与HMGB1结合于同一受体,但AGE并不抑制HMGB1对HSC的激活。 以上结果为以HMGB1为靶点的肝纤维化和肝硬化治疗提供了新的思路和实验依据。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R575.2

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本文编号：2681612