【摘要】： microRNAs(miRNAs)是一类大小为18-23 nt的小的非编码RNA分子,它们是由具有发夹结构的、70-90个碱基大小的单链miRNA前体(pre-miRNA)经Dicer加工产生。miRNA在生物界中是广泛存在的,自从第一个miRNA分子在线虫中发现,迄今为止,已发现在人、动物、植物等多种生物中存在。目前,已有超过3,500个miRNA被鉴定,在人体中miRNA的种类也超过了450种。 研究发现,miRNA序列不是任意的,在很大的进化距离中具有保守性,提示这种分子在生命活动中可能扮演重要的角色。miRNA在胞浆中与Argonaute等蛋白分子形成miRISC(miRNA induce silencing complex);在miRNA的指引下,miRISC可以特异性的识别mRNA分子的3'端约30碱基长度的非编码区,并以一种不完全匹配的方式结合,抑制mRNA翻译蛋白分子。正是由于这种不完全匹配的结合方式,使得一种miRNA可以同多种mRNA分子结合。人们通过生物信息学手段发现,人类有1/3以上的的蛋白编码基因中都受miRNA调节。miRNA通过调节目的蛋白的表达,在生物体发育、信号传导、凋亡、细胞增殖等生理和病理过程中都发挥重要作用。 既然miRNA在生命活动中扮演如此重要的角色,它们是否也在病毒感染性疾病中的发生、发展过程中也有重要作用?miRNA本身的几个特性提示其可能在病毒感染过程中发挥作用。一方面,miRNA分子较小,没有免疫原性,可以逃避机体的免疫系统;miRNA较小,只有22 nt左右大小,对于充分利用基因组每个碱基的病毒来说通过编码小分子量的miRNA来调控基因是一种十分“经济”的选择;另外,一种miRNA可与多个mRNA结合,调节多种蛋白的表达,是一种十分有效的调控基因表达的手段。因此,病毒完全有可能借助于miRNA调控众多蛋白表达,使宿主细胞的内环境有利于病毒的生命活动。后续的大量研究结果也证实了上述猜想,很多病毒可以通过某些机制,改变宿主细胞内各种miRNA表达,使宿主细胞内环境有利病毒的生存。这种现象也提示我们可以通过研究宿主细胞感染病毒前后各种miRNA表达变化,并在此基础之上,研究表达发生改变的miRNA的作用的靶标分子,探索这些miRNA在病毒生命周期中的作用,将有利于我们深入了解病毒感染性疾病的发病机制,并能为这类疾病的诊断、预防及治疗等提供有益的帮助。 乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV),是一种小的双链DNA病毒,是目前已知的感染人类最小的双链DNA病毒,属于属于嗜肝DNA病毒科(hepadnavividae)。HBV感染肝细胞后,能引起一系列的疾病,如急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等,还往往伴有严重的并发症。据推测,世界范围内有3.5亿人为乙肝慢性感染,是威胁人类健康的主要的感染性疾病之一。尽管迄今为止,关于HBV感染的研究取得一定的进展,对于这种疾病的发生、发展、转归及防治有了一定程度上的认识。但在这些领域还有很多未知的空白有待填补。寻找HBV感染后肝脏细胞内表达水平发生改变的miRNA,然后在此基础之上研究这些特定miRNA功能,看其是否在HBV感染过程中发挥作用,或许有利于进一步揭示HBV感染、特别是慢性HBV感染的致病机制。正是基于此,在本研究中,我们利用miRNA芯片技术,分析HBV感染前后miRNA变化情况,寻找显著上调或下调的miRNA;然后分析这些miRNA的功能,看其是否在HBV感染中发挥作用;以期为HBV感染机制的阐明,以及乙型肝炎的预防和治疗提供帮助。 首先,我们利用Exiqon公司的miRNA microarray芯片(8.0),以HepG2.2.15为实验组,以HepG2细胞为对照,分析二者miRNA表达谱系的差异,找出表达水平显著改变(上调或下调超过2倍)的miRNA。HepG2.2.15细胞是人肝癌细胞株HepG2细胞转染HBV基因后的细胞,HBV基因已稳定整合,能分泌各种病毒蛋白和病毒颗粒,是研究HBV感染的一个理想的体外模型。Exiqon公司的miRNA microarray芯片能检测到miRBase数据库(8.0版)中所有已注册的人的miRNA分子;而且该芯片基于锁核酸(Locked Nucleic Acids,LNA)技术构建,使芯片杂交时具有较高而一致的杂交温度,可以较灵敏、特异性地检测差异表达的miRNA。利用该芯片对HepG2.2.15和HepG2细胞的miRNA表达谱进行分析后,发现有9个miRNA的表达发生显著变化。其中上调的有3个,分别为hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345;下调的miRNA共有6个,分别为:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b。 为了进一步验证上述芯片结果的可靠性,我们采用Taqman miR-qRT-PCR试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,America)对HepG2和HepG2.2.15细胞中上述9种miRNA分子表达情况进行分析。U6是一种在各种细胞中表达较为稳定的RNA,在本实验中作为内对照使用。所得数据采用2~(-△△CT)方法进行分析。最终分析结果与芯片结果相符,即显著下调的为hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f和hsa-miR-23b;而显著上调的miRNA为hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345,说明芯片结果是可靠的。 然后,我们进一步验证上述miRNA表达发生改变,是HBV引起的一种特异性变化,还是一般病毒感染后引起的一种非特异性变化。我们首先建立了4种非HBV感染的HepG2细胞,并进行了鉴定。这4种病毒分别为猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus,FIV)、鼠干细胞病毒(Murine Stem Cell Virus,MSCV)、登革病毒(Dengue virus,DV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV),其中前3种为RNA病毒,后一种为DNA病毒。然后,利用Taqman RT-PCR试剂盒检测这些病毒感染细胞株(即HepG2-FIV、HepG2-MSCV、HepG2-DV、HepG2-HSV)中hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-24、hsa-let-7a、hsa-let-7c、hsa-let-7f、hsa-miR-23b、hsa-miR-194、hsa-miR-200a和hsa-miR-345的表达情况。结果表明在这些非HBV感染的HepG2细胞中,上述miRNA的表达未发生显著性改变,提示,HepG2.2.15细胞中上述miRNA表达发生显著改变是HBV特异性的。 由于HepG2.2.15是通过将含有HBV全基因组的质粒转染HepG2细胞建立的稳定克隆,是模拟HBV感染,与真正的HBV感染细胞有一定的差异。而PLC/PRF/5是从—HBV感染者体内分离得到,是自然整合有HBV的一株肝癌细胞株,是研究HBV感染的另外常用的体外模型。因此,我们进一步检测了上述miRNA在该细胞中的表达情况。实验结果表明:hsa-miR-194和hsa-miR-200a显著性上调;hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f下调表达,而hsa-miR-24、hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-23b和hsa-miR-345的表达水平则没有发生显著性变化。提示hsa-miR-194、hsa-miR-200a、hsa-let-7a、hsa-let-7c和hsa-let-7f表达发生改变可能与HBV感染相关。 但无论分析miRNA在HepG2.2.15细胞的表达情况、在非HBV感染细胞株中的表达情况,还是在PLC/PRF/5细胞的表达情况,只是为我们提供了一种离体状态下的情况。真正的体内过程往往与体外过程有不小的差异,因此我们进一步检测了miRNA在慢性乙肝患者肝脏标本中的表达情况,揭示miRNA在体内的表达状态。利用定量PCR方法检测了12个慢性乙肝患者的穿刺标本miRNA表达情况,以3例肝移植手术中健康供体肝脏组织作为正常对照。结果表明:hsa-miR-30a-5p、hsa-miR-345、hsa-miR-23b、hsa-miR-194表达水平没有发生显著性改变;hsa-miR-24、hsa-let-7c和hsa-mir-200a在某些标本中表达下调,而在另外一些标本中则表达上调;只有hsa-let-7a和hsa-let-7f在12例标本中均显著性下调。综上所述,hsa-let-7a和hsa-let-7f最可能是HBV感染后肝脏细胞内表达水平发生显著改变的miRNA。那么,是否HBV通过下调hsa-let-7a和hsa-let-7f,改变肝脏细胞内环境,使之更有利于HBV的感染过程? 既往研究表明,miRNA可能通过以下几种机制参与病毒感染的致病过程:宿主的miRNA作用于病毒基因,调控病毒基因的表达;病毒基因组编码病毒来源的miRNA,调控病毒基因的表达;病毒基因组来源的miRNA作用宿主基因,调控宿主基因的表达。因此,HBV感染后肝细胞内变化的miRNA,即hsa-let-7a和hsa-let-7f是否也可以作用于HBV基因,并调控这些基因编码蛋白的表达? ViTa是由Hsu PW等建立的一个软件(http://vita.mbc.nctu.edu.tw/),可以较好地预测人的miRNA在病毒基因中靶标。我们借助于该软件预测了hsa-let-7a和hsa-let-7f在HBV基因组中的靶标。预测结果表明:hsa-let-7a在HBV基因组中有一个潜在的靶标,3105-3135处位于Pres1和多聚酶(P蛋白)的共同编码区(3105-3135处),该区域在乙肝的生命周期中具有重要作用;没有发现HBV基因组中有hsa-let-7f的作用位点。 为了验证该潜在位点是否为hsa-let-7a的作用位点,我们将该序列导入pMIR-REPORT荧光素酶表达载体,构建报告系统;同时,将let-7a表达质粒PH1-RNA-let-7a导入293T细胞,通过抗生素筛选后得到单克隆,qRT-PCR鉴定后,我们得到2株稳定表达let-7a的细胞株,293-7a-1和293-7a-2。将含有靶序列的pMIR-report导入293-7a-1和293-7a-2后,进行荧光素酶实验,结果提示,hsa-let-7a可以作用该位点,降低荧光素酶的表达。为进一步验证,我们将let-7a表达质粒导入HepG2.2.15细胞株,上调hsa-let-7a的表达,检测HBV拷贝数及上清中Pres1蛋白水平变化情况。实验结果表明,hsa-let-7a上调后,HBV DNA拷贝数显著降低,上清中pres1蛋白水平也明显下降,进一步证实了HBV基因组中hsa-let-7a作用位点的存在。 综上所述,在本实验中,我们借助于microRNA芯片技术,以HepG2.2.15细胞作为HBV的体外感染模型以HepG2细胞作为对照,分析表达显著改变的miRNA;然后利用定量PCR对芯片结果进行验证后,进一步检测了这些miRNA在一系列的细胞株及慢性乙肝患者肝穿标本中的表达情况,结果提示HBV感染引起肝细胞内hsa-let-7a和hsa-let-7f显著下调。然后,我们进一步分析了hsa-let-7a和hsa-let-7f的靶标,利用ViTa软件预测二者在HBV基因组的潜在作用位点,并通过荧光素酶等实验进行了验证。结果发现hsa-let-7a能作用于HBV的多聚酶和PreS1蛋白的共同编码区。或许,HBV感染肝细胞后,通过某种机制下调hsa-let-7a的表达,使HBV的PreS1蛋白和多聚酶免受let-7a的抑制,从而使肝细胞内环境有利于HBV的生命活动,可能是HBV感染的致病机制之一。
【图文】：
值三2.1判断为阳性，否则为阴性。阴性对照OD值低于0.05时作0.05计算，高于0.05时按实际OD值计算。令士甲二曰刁又一、间接免疫荧光法检测HePGZ和HePG2.2.15细胞白蛋白表达结果白蛋白是体内特异地由肝细胞合成和分泌的蛋白[30]，，其在细胞中表达标志着肝细胞原型和功能。本实验中，我们使用兔抗人Albumin抗体(Merck)，间接免疫荧光法检测HePGZ和HePG2.2.巧细胞中人白蛋白表达情况，以人脐静脉内皮细胞株Ecv304细胞作为阴性对照。间接免疫荧光组化染色显示:在HePGZ和HePG2.2.15细胞胞浆中都有绿色荧光存在，而ECv304细胞的胞浆中则没有，提示HePGZ和HePG2.2.15细胞能合成白蛋白，是肝脏来源的细胞。
hsa一miR一3450.0514859230刃25547hsa-miR一200a3541330.0921532850.03307表5.下调表达的m1RNATab5.Down一regulatedmiRNAHePG22.15HePGZ实验组标准值对照组(对照组)RowNamC(实验组)hsa一miR一30a一SPhsa-mi凡24hsa一let一7f0.0634124090.128603894681960.82302308394160.5160.2320776850.7880、1833289890‘5481163040742021651083:5力3231494243886n目IJn，n只叮产hsa·!et一7ahsa一let一7e5hsa一miR一23b14620.3810610010.774CCC川沁rb.sedonsortedrawd成aaa
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R512.6
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2692025
