HMGB1在HBV复制中的作用研究

发布时间：2020-06-05 15:45

【摘要】：目的： HMGB1是近年发现在多种病毒性疾病的发病机制中起重要作用的细胞因子之一，但其在HBV感染中的作用仍未见相关报道。本研究拟首先通过检测HMGB1在HepG2.2.15细胞中的表达水平了解其在HBV感染中的表达情况，然后通过加入外源性HMGB1刺激HepG2.2.15细胞，检测HBVDNA、HBsAg和HBeAg的表达变化，以探讨HMGB1在HBV复制中的作用，为进一步研究乙肝发病机制提供理论依据。方法：用实时荧光定量PCR法和Westernblot法从基因水平和蛋白水平检测HMGB1在HepG2和HepG2.2.15细胞中的表达情况；分别以不含HMGB1培养基（control组）及含HMGB1培养基（100μg/LHMGB1刺激组）体外培养HepG2.2.15细胞0、12、24、36、48、72和96h，用雅培化学发光法检测HBSAg、HBeAg的表达，用实时荧光定量PCR法检测HBVDNA的表达。结果： HMGB1基因和蛋白在HepG2和HepG2.2.15细胞中均有表达，且在HepG2.2.15细胞中的表达明显高于HepG2细胞；HMGB1刺激后24-96hHBVDNA、HBsAg和HBeAg的表达逐渐增强，与0h相比均有显著性差异（p0.05或p0.01），，且与control组相比，亦有显著性差异（p0.01）。结论： HMGB1在HepG2.2.15细胞中的表达高于HepG2细胞，说明HMGB1与HBV感染有关；HMGB1体外刺激HepG2.2.15细胞能增强HBVDNA、HBsAg和HBeAg的分泌，促进HBV复制；HMGB1持续刺激可使HBV复制更活跃，可能是导致HBV持续复制的关键因素之一。目的：第一部分研究表明HMGB1体外刺激HepG2.2.15细胞能够促进HBV复制，但具体分子机制不明。本研究拟通过HMGB1体外刺激HepG2.2.15细胞后检测toll样信号通路相关信号分子及HNF4α的表达,初步探索HMGB1促进HBV复制的可能机制，为临床乙肝治疗提供新的靶点。方法： 100μg/LHMGB1刺激HepG2.2.15细胞培养0、12、24、36、48、72和96h，用流式法测细胞表面TLR2、TLR4的表达；用Westernblot法测Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB蛋白水平的变化；用实时荧光定量PCR、Westernblot测HNF4α的表达变化；用细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察NF-κB、HNF4α含量变化。结果：流式结果表明TLR2、TLR4在HepG2.2.15细胞中均有表达，且TLR4表达显著性高于TLR2，HMGB1刺激HepG2.2.15细胞后，TLR2表达无明显变化，TLR4的表达于12-96h呈现为高表达；Westernblot结果提示Myd88、JNK、ERK、p38MAPK和NF-κB在蛋白水平于HMGB1刺激0h均表达较弱，HMGB1刺激后表达均逐渐增强；实时荧光定量PCR、Westernblot结果提示HMGB1刺激HepG2.2.15细胞后，HNF4α基因水平和蛋白水平表达均随刺激时间的延长而表达增强，并于48-96h呈显著性升高，实时荧光定量PCR与Westernblot程度趋于一致；免疫荧光、激光共聚焦结果显示NF-κB在HepG2.2.15细胞中于HMGB1刺激后12-48h由胞浆逐渐转位至胞核，HNF4α的表达在HepG2.2.15细胞主要位于胞核，HMGB1刺激HepG2.2.15细胞后，绿色荧光随刺激时间延长荧光亮度增强。结论： HMGB1在HepG2.2.15细胞中信号通路主要由TLR4介导；HMGB1体外刺激HepG2.2.15细胞能够上调HNF4α的表达，且上调的HNF4α与HBVDNA的表达呈正相关；HMGB1可以通过TLR4-MyD88-MAPK-NF-κB通路上调HNF4α，促进HBV复制。
【图文】：

琼脂糖凝胶电泳,脂糖,细胞,分光

（图 1 ）。用分光光度计测得各组总 R NA OD 2 6 0/ OD 2 8 0 比值均在 1. 8 -2 . 0 之间，表明总 R NA 提取质量好，可以作为 re a l -t i m e P C R 反应模板进行扩增。图1提取的总R N A琼脂糖凝胶电泳图Fi g 1 A g a ro s e e le c tr o p h o re s is o f to t a l mR N A e x t r a c te d3. 1 . 2 H ep G2 和 H ep G2 .2 . 15 细胞中 H MG B 1 mR NA 的表达变化抽提 He p G 2 和 He p G2 . 2. 1 5 细胞总 R NA 进行 re a l -t i m e RT - P C R 扩增，结果显示 HM BG 1 m R NA 在 He p G 2 . 2 .1 5 细胞中显著性高于 He p G 2 细胞（ p< 0 .0 1 ，图 2 、3 、 4）。

扩增曲线,电泳,曲线

图2 H MG B 1的扩增曲线 Fi g 2 A mp li f ic a t io n c ur v e fo r re a l- t im e PC R pr o du c ts 1 2H MG B1 G A PD H1：H e pG 2 . 2 . 1 5细胞； 2：H e pG 2细胞图3定量PC R产物的电泳检测 Fi g 3 El e c tr o ph o re s is a na ly s is o f th e re a l- t im e RT - P C R pr o du c ts
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62

【参考文献】