嗜酸性粒细胞诱导食管壁内神经元损伤在贲门失弛缓症发病机制中的探讨

发布时间：2020-06-10 13:39

【摘要】：目的食管壁内神经元减少是导致贲门失弛缓症患者食管动力障碍的主要机制,但其原因不明。我们通过分析嗜酸性粒细胞在贲门失弛缓症患者食管肌层的分布以及与食管壁内神经元表达的相关性,研究嗜酸性粒细胞在动物实验及体外实验中对食管壁内神经元的损伤作用及机制,探讨抗嗜酸性粒细胞药物对贲门失弛缓症的治疗作用。方法(1)纳入于我院就诊并经胃镜、钡餐及食管测压等确诊为贲门失弛缓症并接受POEM治疗的28名患者作为贲门失弛缓症组,同时选取行外科食管切除术的食管癌患者9例作为对照组。实验组标本取自POEM术中粘膜下隧道建立后,分别活检食管LES部位、LES上方5cm及LES上方10cm部位(远段、中段及近段食管)的环形肌组织。对照组标本取自正常食管组织肌条,同样于术中选取与贲门失弛缓症患者取材部位相对应的食管体部近段、中段及远段的肌层组织。所有标本均行HE染色观察食管肌层组织的嗜酸性粒细胞计数及分布,并比较不同部位之间计数及分布的差异。行免疫组化观察嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)、嗜酸性粒细胞来源神经毒素(EDN)、嗜酸性粒细胞趋化因子以及食管壁内神经元的分布。分析贲门失弛缓症患者食管肌层嗜酸性粒细胞计数与临床数据的关系。(2)取Balb/c小鼠20只,分为模型制作组及正常对照组。通过OVA致敏的方式制作嗜酸性粒细胞浸润食管肌层的动物模型,行高分辨率食管测压及食管排空检查观察模型组小鼠与对照组小鼠食管运动功能的差异,行HE观察两组小鼠食管肌层嗜酸性粒细胞浸润程度,行免疫组化观察两组小鼠食管ECP、EDN、嗜酸性粒细胞趋化因子以及食管壁内神经元的表达。另取60只Balb/c小鼠,随机分为OVA处理实验组和对照组,分别于实验前、实验第20天、28天、35天、50天及75天通过高分辨率食管测压及食管排空检查检测食管运动功能的变化,通过HE染色观察食管不同部位嗜酸性粒细胞聚集的情况,通过免疫组化观察食管ECP、EDN、嗜酸性粒细胞趋化因子以及食管壁内神经元的表达。(3)取健康小鼠5只,分离嗜酸性粒细胞及食管肠神经元细胞进行体外培养,嗜酸性粒细胞与肠神经元共培养组为实验组,在肠神经元细胞中加入提纯的ECP为干预组,单纯培养的肠神经元细胞作为对照组,通过MTT法观察共培养不同时间嗜酸性粒细胞及ECP对肠神经元细胞活力的影响,通过流式细胞检测嗜酸性粒细胞及ECP处理的肠神经元细胞死亡的百分比。进一步分离嗜酸性粒细胞浸润食管肌层的动物离体食管平滑肌条,取健康小鼠离体食管平滑肌条作为对照组,置入装有Krebs液的恒温平滑肌槽中,部分对照组Krebs液中加入嗜酸性粒细胞培养上清液,生物机能实验系统记录电刺激下肌条收缩的幅度及变化。(4)取Blab/c小鼠40只,随机分为4组,OVA模型组,Siglect抗体药物干预组,CCR3单抗药物干预组以及健康对照组。通过高分辨率食管测压及食管排空检查观察不同组小鼠实验前后食管运动功能的改变及差异,通过HE染色观察实验前后不同组小鼠食管嗜酸性粒细胞计数的变化及差异,通过免疫组化染色观察实验前后不同组小鼠食管ECP、EDN以及食管壁内神经元的分布及变化。结果(1)与对照组相比,贲门失弛缓症患者食管肌层不同部位嗜酸性粒细胞计数及分布均明显增多(P0.05),不同部位食管肌层嗜酸性粒细胞浸润无明显差异(P0.05)。贲门失弛缓症患者食管肌层ECP、EDN及嗜酸性粒细胞趋化因子可见不同程度的分布,食管壁内神经明显减少或消失,对照组食管组织中未见明显ECP、EDN及嗜酸性粒细胞趋化因子的表达,食管壁内神经元未见明显病理改变。贲门失弛缓症食管肌层嗜酸性粒细胞数量与POEM术后1年的Eckardt评分有相关性。(2)通过高分辨率食管测压结果显示,与对照组相比,模型组小鼠食管LES部位压力明显增高(P0.05)。通过食管排空检查结果显示,与对照组相比,模型组小鼠食管体部排空时间及食管排空通过贲门的时间均明显延长(P0.05)。HE染色及免疫组化结果显示,模型组小鼠食管肌层有大量嗜酸性粒细胞浸润,ECP、EDN呈阳性表达,食管壁内神经元明显减少或消失。且不同时段的食管测压及食管排空检查显示,食管LES部位压力及食管排空时间随着造模时间的延长,均逐步增加。HE及免疫组化结果表明,随着食管肌层嗜酸性粒细胞浸润数量的增加,食管壁内神经元的表达逐渐减少或消失。(3)正常培养的肠神经元细胞3天后的死亡率为8.41%,与嗜酸性粒细胞共培养的肠神经元细胞死亡率为51.2%,在正常培养的肠神经元细胞中添加ECP蛋白后,神经元的死亡率增加至62.2%,三组数据之间差异有明显统计学差异(P0.05)。与正常培养的肠神经元相比,与嗜酸性粒细胞共培养以及加入重组ECP蛋白组的肠神经元活性在24h及48h均有明显下降(P0.05)。在一定参数电刺激下,模型组小鼠食管平滑肌条收缩幅度与健康对照小鼠对比,幅度明显降低(P0.05)。干预组与健康对照组未见显著差异(P0.05)。(4)通过抗嗜酸性粒细胞药物干预后,通过高分辨率食管测压以及食管排空检查观察模型组小鼠LES部位压力及食管排空时间与Siglect抗体药物干预组、CCR3单抗药物干预组以及健康对照组小鼠相比,均明显增加。HE染色及免疫组化结果显示,模型组小鼠食管肌层有大量嗜酸性粒细胞浸润,ECP、EDN呈阳性表达,食管壁内神经元明显减少或消失。而其他三组小鼠食管肌层未见明显炎性物质的表达,食管壁内神经元未见明显变化。结论贲门失弛缓症患者食管肌层有不同程度嗜酸性粒细胞的浸润,且与POEM术后疗效相关;通过OVA可以制作嗜酸性粒细胞浸润食管肌层的动物模型,且嗜酸性粒细胞的浸润与食管壁内神经元的减少有关并影响食管运动功能;体外培养的嗜酸性粒细胞可以损伤肠神经元细胞,且改变离体食管平滑肌的收缩功能;抗嗜酸性粒细胞药物可以改善贲门失弛缓症动物模型的食管运动功能,减少食管壁内神经元的损伤。
【图文】：

岁 51.1±14.5 (24 78) 60.8±9.6 (45 75病程，月 28.0±18.4 (5 80) -芝加哥分型 (I /II / III) 12/14/2 -POEM 术前 Eckardt 评分 8.1±1.6 (5 12) -POEM 术后 1 年 Eckardt 评分 2.3±1.3 (0 4) -1.2.2 活化的嗜酸性粒细胞在食管不同部位的分布HE 染色镜检显示 28 例贲门失弛缓症患者中，有 24 例（85.7%）患者食管肌层发现不同程度的嗜酸性粒细胞浸润，表现为近短食管、中段食管及远段食管肌层组织可见不同程度的嗜酸性粒细胞浸润，其中有 8 例（28.6%）贲门失弛缓症患者食管肌层每高倍镜下可见 15 个以上的嗜酸性粒细胞，呈弥漫或多灶性分布，部分可伴有少量淋巴细胞浸润。食管黏膜层中均未发现有嗜酸性粒细胞浸润。9 例对照组 HE 染色镜检仅有 1 例显示轻微炎症变化，其余均未见嗜酸性粒细胞及淋巴细胞浸润（图 1）。

图 2 贲门失弛缓症及对照组食管嗜酸性粒细胞炎性物质及食管壁内神经元的表达（免疫组化：40×）a：贲门失弛缓症患者食管 ECP 免疫组化染色；b：贲门失弛缓症患者食管 EDN 免疫组化染色；c & d：贲门失弛缓症患者食管 S100 免疫组化染色；e：正常对照组食管 ECP 免疫组化染色；f：正常对照组食管 EDN 免疫组化染色；g & h：正常对照组食管 S100 免疫组化染色。1.2.4 嗜酸性粒细胞趋化因子在贲门失弛缓症食管肌层的表达在 28 例贲门失弛缓症患者的食管组织中，，有 18 例（64.3%）的患者在食管肌层发现有嗜酸性粒细胞趋化因子-3（eotaxin-3）的表达，贲门失弛缓症的食管黏膜层以及对照组的食管全层中均未发现有嗜酸性粒细胞趋化因子-3 的阳性表达（图 3）。a b
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R571

【参考文献】

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1 徐晓s

本文编号：2706366