鸡尾酒疗法作用肝星状细胞的定量蛋白质组学研究

发布时间：2020-06-20 01:27

【摘要】：背景：肝纤维化是由各种致病因子所引起的组织修复过程,主要表现为细胞外基质在肝脏内过度沉积,它是肝硬化乃至肝癌共同的病理基础。因此,探寻有效治疗肝纤维化的方法是非常必要和迫切的。近年来,许多研究证实肝纤维化是可以逆转的,对抗肝纤维化药物的研究也取得了一定的进展,但肝纤维化发生机制复杂,而着眼于阻断发病机制某一环节的药物治疗见效不大。本研究小组前期应用表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、牛磺酸(Taurine)和三羟基异黄酮(Genistein)三种具有不同抗纤维化作用机理的药物联合组成鸡尾酒(Cocktail)进行了一系列体内外实验,发现其具有抗肝纤维化作用。 目的：本研究运用iTRAQ技术结合高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)的定量蛋白质组学方法,研究鸡尾酒作用肝星状细胞株HSC-T6后,细胞的整体蛋白表达水平发生的变化,分析和鉴定细胞中差异表达的蛋白质,从蛋白质水平探讨鸡尾酒疗法抗肝纤维化的作用机理,以期为肝纤维化的诊断、治疗和预后寻找可靠的生物标志物。 方法：以HSC-T6作为靶细胞,经Cocktail作用后,采用MTT法测定药物对细胞增殖的影响,确定Cocktail对HSC-T6增殖抑制的最佳浓度；然后提取Cocktail最佳浓度作用下肝星状细胞株HSC-T6的细胞总蛋白,用bradford法定量蛋白质浓度；取等量蛋白用胰蛋白酶(Trypsin)酶解,再以同位素标签的iTRAQ标记蛋白质肽段,经阳离子柱(SCX)分离后,利用LC-ESI-MS/MS进行质谱检测差异表达的蛋白质,后采用Mascot进行IPI大鼠蛋白数据库搜索鉴定蛋白质,运用生物信息学分析差异表达的蛋白质功能。 结果：(1)鸡尾酒疗法对HSC-T6增殖有抑制作用,cocktail低、中、高剂量组与对照组的A值比较有显著性差异(0.12210.009,0.154±0.016,0.187±0.052VS0.223±0.032, P0.05),中剂量与低剂量之间无显著差异(P0.05),低剂量、中剂量与高剂量组间有显著差异(P0.05)；(2)质谱共鉴定分析出727种蛋白质。根据当蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上,且经统计检验其p-value值小于0.05时,视为差异蛋白。与对照组相比,三次生物学重复鉴定到的差异蛋白数量分别：第一次实验共发现285种差异表达的蛋白质,其中119种蛋白质上调,166种蛋白质下调；第二次重复实验时共找到331种差异表达蛋白质,其中126种蛋白质上调,205种蛋白质下调；第三次重复实验时发现330种差异表达蛋白质,130种蛋白质上调,200种蛋白质下调。经过分析发现,三次生物学重复均鉴定到的差异蛋白为36个,其中表达上调的差异蛋白有11个,表达下调的差异蛋白有25个。通过对这些差异蛋白进行蛋白质功能分析,发现其参与翻译后修饰、转录、重组和信号传导通路等过程。 结论：(1)鸡尾酒疗法具有抑制HSC-T6增殖的作用,Cocktail低剂量组(taurine15μg/ml+EGCG17.5μg/ml+genistein3.5μg/ml)具有较好的抑制作用；(2)丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶、基质金属蛋白酶抑制剂1、半乳糖凝集素-3结合蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1、层粘连蛋白等可能参与Cocktail对HSC-T6的抗纤维化作用；(3)半乳糖凝集素-3结合蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂1可作为肝纤维化早期诊断候选标志物。(4)鸡尾酒疗法的抑制HSC-T6增殖及抗纤维化的作用,可能是通过对蛋白进行调控表达来实现。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2

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本文编号：2721646