腺苷酸活化蛋白激酶在酒精性肝病中的表达及意义

发布时间：2020-06-21 14:54

【摘要】： 目的:酒精性肝病(ALD)是长期大量饮酒所致的肝脏损害性病变,其病理改变包括酒精性脂肪肝、酒精性脂肪性肝炎、酒精性肝纤维化及酒精性肝硬化。关于ALD的发病机理目前尚不清楚,近年来有人提出以氧化应激和脂质过氧化为中心的“二次打击”假说,“第一次打击”使脂肪合成增加,脂类沉积在肝细胞,导致脂肪肝,“第二次打击”涉及氧化应激和脂质过氧化。乙醇进入人体后,代谢为乙醛和乙酸,对肝脏有直接毒性作用,可降低肝脏的抗氧化能力,引起脂质过氧化,从而导致肝脏损伤。乙醇氧化过程中,还原型辅酶I (NADH)产生增加,抑制三羧酸循环,使肝内脂肪代谢障碍,导致脂肪堆积于肝脏中。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)存在于线粒体内,属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族成员,由α、β、γ三个亚基构成,α为催化亚基,β和γ为调节亚基。AMPK各亚基的组织分布不同,α1分布很广,α2主要分布在肝脏、骨骼肌和心脏。AMPK的活性受AMP/ATP比值的调控,被称为细胞的“代谢感受器”或调控ATP和AMP水平的“燃料开关”。当AMP/ATP比值升高时,AMPK被激活,可增强肝脏、肌肉等组织对葡萄糖的摄取、脂肪的氧化作用及胰岛素的敏感性,并减少葡萄糖、胆固醇和甘油三酯的合成。在正常肝组织中表达较多量的AMPK,当肝组织受损时,肝组织表达AMPK减少。乙酰辅酶A羧化酶(ACC)是脂肪酸合成的限速酶,AMPK能磷酸化ACC的79位点苏氨酸而使其失活,从而使脂肪酸活化,进而进入β-氧化过程。固醇调控元件结合蛋白(SREBP)是一类位于内质网和核被膜上的膜连接蛋白,是参与脂肪合成基因的主要转录调节因子。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)是胆固醇合成的限速酶,ACC、HMGR的基因为SREBP的靶基因,且二者又为AMPK的重要下游靶分子,因此,SREBP可能与AMPK调节脂肪酸和胆固醇代谢的作用有关。AMPK可通过降低ACC、SREBP等下游激酶的活性抑制脂肪合成、促进脂肪氧化分解。本研究旨在应用酒精灌胃建立大鼠ALD模型,用免疫组织化学染色观察AMPK-α2、ACC、SREBP-1c的表达,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法观察AMPK、ACC、SREBP mRNA的表达情况,用Western Blotting观察AMPK-α2蛋白的含量,探讨AMPK在ALD发病过程的表达及意义,为有效防治ALD提供新的思路。方法:选用雄性健康清洁级Wister大鼠50只,体重200±20g,正常饲养1周后随机分出10只为正常对照组,其余动物采用逐渐增加酒精浓度(浓度30%-60%,乙醇5-9g·kg-1·d-1)的方法酒精灌胃,分别于4周、8周、12周和16周末随机处死动物10只、9只、8只和8只,留取血清及肝组织标本;检测血清ALT、AST、TG、TC、HDL、LDL等生化指标;取部分肝组织立即冰冻切片行苏丹Ⅳ染色,观察肝细胞脂变性情况;另取肝组织固定于4%中性福尔马林溶液,石蜡包埋,行苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织的普通病理改变,天狼红染色观察肝组织纤维化程度,过碘酸希夫染色(PAS)观察肝组织胞浆糖原变化;并用行AMPK-α2、ACC及SREBP-1c免疫组织化学染色,观察肝组织AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白表达情况;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱,用RT-PCR观察大鼠肝组织AMPK、ACC及SREBP mRNA的表达,用Western Blotting观察AMPK-α2蛋白的表达情况。结果: 1血清肝功能指标的变化:随着造模时间的延长,血清ALT和AST水平逐渐升高,CHE逐渐降低,与正常对照组比较P0.05或P0.01。 2血清血脂指标的变化:随着造模时间的延长,血清TG、TC、LDL、VLDL的水平逐渐升高,HDL水平逐渐降低,与正常对照组比较P0.05或P0.01。 3肝组织病理学改变:4周大鼠肝细胞出现小叶中央静脉周围肝细胞脂肪变性,随着造模时间的延长,肝细胞脂肪变性逐渐加重,肝小叶内坏死灶明显增多和纤维组织增生,16周大鼠肝细胞呈现弥漫小泡性脂肪变性,窦周纤维化,汇管区纤维组织增生并有纤维间隔形成。冰冻切片苏丹Ⅳ染色显示正常对照组大鼠肝组织无脂肪变性,模型4周组大鼠肝细胞胞浆中出现少量红色脂滴,随着造模时间延长,红色脂滴逐渐增多,至16周表现为大量红色脂滴分布于肝细胞内。PAS染色显示正常组大鼠肝细胞胞浆中大量紫红色颗粒分布,模型16周仅见机少量紫红色颗粒。天狼红染色显示模型4周组大鼠肝组织无明显纤维组织增生,模型12周组大鼠肝组织出现明显窦周纤维化和纤维化间隔形成趋势,模型16周组大鼠肝组织出现明显纤维间隔。 4免疫组化法检测大鼠肝组织AMPK-α2、ACC及SREBP-1c蛋白的表达:光镜下,正常组大鼠肝脏内表达较多的AMPK-α2蛋白,随着造模时间的延长阳性表达逐渐减少,主要表达于肝细胞胞浆内;正常组大鼠肝脏表达ACC较少,随着造模时间的延长,ACC表达逐渐增加,主要表达于细胞浆内;正常组大鼠肝脏表达SREBP-1c较少,随着造模时间的延长,SREBP-1c表达逐渐增加,主要表达于细胞浆或细胞核内。 5 RT-PCR法检测AMPK、ACC及SREBPmRNA的表达量:正常组大鼠肝组织中表达较多的AMPK mRNA,随着造模时间的延长,表达量逐渐减少,与正常对照组比较P0.05;正常组大鼠肝组织中表达ACCmRNA较少,随着造模时间的延长,其表达量逐渐增加,与正常对照组比较P0.05;正常组大鼠肝组织中表达SREBPmRNA较少,随着造模时间的延长,其表达量逐渐增加,与正常对照组比较P0.05。 6 Western Blotting法检测大鼠肝组织AMPK-α2蛋白的表达:正常组大鼠肝脏内表达较多的AMPK蛋白,随着造模时间的延长,AMPK蛋白表达逐渐减少,与正常对照组比较P0.05。 7肝组织中AMPK-α2的相对表达量与血清ALT、AST水平呈负相关,相关系数分别为-0.702和-0.487,P值分别为P0.01和P0.01,与CHE呈正相关,相关系数为0.606,P0.01。 8肝组织中AMPK-α2的相对表达量与血清TG、TC、LDL、VLDL的水平呈负相关,相关系数分别为-0.501、-0.619、-0.586和-0.388,P值分别为P0.01、P0.01、P0.01和P0.05,与HDL呈正相关,相关系数为0.563,P0.01。 9肝组织中AMPK-α2的相对表达量与ACC、SREBP-1c的表达量均呈负相关,相关系数分别为-0.911和-0.907,P值分别为P0.01和P0.01。结论: 1应用逐渐增加酒精浓度和剂量灌胃的方法可以成功制备大鼠ALD模型,该模型肝脏病变如脂肪变性、炎症反应和纤维化等可以反映临床ALD的基本病变。 2 ALD发病过程中存在脂质代谢障碍紊乱,脂肪堆积于肝脏中。 3 ALD发病过程中AMPK表达减少,对下游靶分子ACC、SREBP活化的抑制作用减弱,导致脂质合成增多,氧化分解减少,造成脂肪堆积,参与ALD发病机制的“第一次打击”,是造成肝脏功能损伤的重要因素之一。 4 AMPK作为一个新的药理靶点,为ALD的防治提供了新的思路。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575

【参考文献】