内质网应激状态下靶向干扰PERK基因对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中自噬的影响

发布时间：2017-03-28 17:15

  本文关键词：内质网应激状态下靶向干扰PERK基因对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中自噬的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：急性胰腺炎是发病率和死亡率很高的一种可导致死亡的疾病,它的病理机制尚不明确,而且没有特殊或有效地治疗方法[1,2]。普遍认为,这个病始于腺泡细胞[3]。胰腺炎特征性的表现包括高淀粉酶血症,消化酶在腺泡内异常活化(如胰蛋白酶原变为胰蛋白酶),腺泡细胞中大空泡的积聚,促炎介质的释放(如关键转录因子NF-κB)导致炎症细胞侵入胰腺和全身炎症反应,凋亡和坏死引起的腺泡细胞死亡。有数据表明,急性胰腺炎中存在内质网应激反应。组织学检测提示,在目前所有的实验模型中,急性胰腺炎的早期均可观察到内质网应激的发生。急性胰腺炎中基因表达的改变可以阐释内质网应激反应机制。第一部分稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立研究目的:利用慢病毒感染技术将EGFP-LC3融合蛋白包装成慢病毒以感染至AR42J细胞中。研究方法:利用慢病毒过表达载体Lentiviral-EGFP-LC3,包装成慢病毒,并利用慢病毒转染技术以转染大鼠胰腺腺泡细胞AR42J。利用倒置荧光显微镜镜下观察GFP蛋白的表达。利用流式细胞分析仪鉴定感染效果。RT-PCR及western blot检测EGFP-LC3在稳定细胞株中的表达。实验结果:慢病毒感染AR42J细胞后,倒置荧光显微镜及流式细胞分析仪检测,感染效率均85%。Western blot实验表明EGFP-LC3融合蛋白在AR42J细胞中表达。RT-PCR检测结果显示和未感染组相比,EGFP-LC3组的LC3 m RNA表达水平明显上调,其细胞中LC3 m RNA的表达是未转染组的9.14±0.32倍,二组差异有明显的统计学意义(P0.05),而EGFP组与未感染组相比较,二者差异无明显统计学意义(P0.05)。结论:成功构建了稳定表达EGFP-LC3的大鼠胰腺外分泌细胞AR42J,以及为进一步研究急性胰腺炎与自噬的关系提供了新的细胞模型。第二部分靶向干扰PERK基因的sh RNA真核表达载体的构建及对AR42J-LC3细胞的靶向干扰效果研究目的:运用RNA interference干扰技术,构建靶向干扰PERK基因的短发夹环状小干扰RNA(short hairpin RNA,sh RNA)真核表达载体(慢病毒载体),并采用慢病毒感染技术将U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-PUR-PERK2-sh RNA稳定感染至AR42J-LC3细胞中,以建立靶向干扰PERK基因的AR42J-LC3细胞系,可为进一步研究急性胰腺炎与内质网应激及自噬关系提供进一步的基础。研究方法:1.利用Gen Bank检索大鼠PERK基因序列(NM_031599),根据RNAi序列设计原则,并利用Ambion公司在线序列设计软件辅助设计,设计大鼠PERK基因m RNA的RNAi靶点序列,再运用BLAST检索软件进行检索,对上述所设计的干扰序列进行同源性分析,最后选出3条si RNA作为PERK基因的干扰片段,并利用克隆构建真核表达载体(慢病毒载体),进而对慢病毒载体序列进行基因测序鉴定。随后利用共转染技术将慢病毒载体包装成慢病毒。2.将AR42J-LC3细胞分为5组:空白对照组(Control组)、阴性对照组(NC组)、PERK-sh RNA-1组、PERK-sh RNA-2组、PERK-sh RNA-3组。利用慢病毒转染技术对NC组及各实验组进行感染,随后应用RT-PCR及Western blot鉴定对照组及各感染组细胞中PERK mRNA及蛋白的表达。实验结果:1.测序结果显示PERK基因的sh RNA真核表达载体(慢病毒载体)的构建成功,所构建的靶向PERK基因的3个慢病毒载体分别命作PERK-sh RNA-1、PERK-sh RNA-2、PERK-sh RNA-3。2.RT-PCR结果显示:以Control组为1进行比较,NC组及各实验组的PERK m RNA表达量分别为Control组的1.07±0.07倍、0.54±0.04倍、0.37±0.01倍、0.59±0.03倍。NC组与Control组相比较,二者差异无明显的统计学意义(P0.05),各实验组与Control组相比较均有较大差异,有统计学意义(P0.05)。且PERK-sh RNA-2对PERK m RNA表达的干扰抑制作用最为明显。Western blot检测结果显示:Control组、NC组、各实验组的PERK蛋白相对表达量(PERK/β-actin)分别为:0.69±0.03、0.63±0.04、0.40±0.01、0.21±0.02、0.38±0.01。NC组与Control组相比较,二者差异无明显的统计学意义(P0.05),各实验组与Control组相比较均有较大差异,有统计学意义(P0.05)。且PERK2-sh RNA对PERK基因蛋白表达的干扰下调作用最为明显,和RT-PCR的结果相一致。结论:成功地设计完成了对PERK基因进行干扰的shRNA的真核表达载体的构建,进而建立稳定干扰PERK基因的AR42J-LC3细胞系,为进一步研究急性胰腺炎与内质网应激机制及自噬关系提供了新的体外模型。第三部分内质网应激状态下对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中自噬的影响研究目的:阐明靶向抑制PERK后对内质网应激状态机制下急性胰腺炎体外模型中自噬的影响。实验方法:实验分组:AR42J-LC3组为A组,AR42J-LC3-shPERK为B组,空白对照组(A/B组)、A+雨蛙素组、B+雨蛙素组、A+雨蛙素+毒胡萝卜素组、B+雨蛙素+毒胡萝卜素组,内质网应激模型运用毒胡萝卜素(TG)进行处理,使各组作用时间均为8h,雨蛙素组运用雨蛙素(CAE)进行处理,作用时间也为8h。运用PT-PCR及Westernblot检测自噬相关基因LC3、Beclin1 m RNA及蛋白的表达。同时利用激光共聚焦显微镜来观察自噬的变化。实验结果:RT-PCR及Westernblot结果显示下调PERK可以减少LC3-I向LC3-II转化、以及Beclin1的表达。利用共聚焦显微镜观察自噬变化,发现下调PERK后,在内质网应激状态下,胰腺炎中自噬体的形成也相对减少。结论:进一步阐明了PERK参与了内质网应激状态下胰腺炎中自噬的形成,
【关键词】：EGFP-LC3 慢病毒感染 AR42J细胞 稳定表达 自噬 AR42J-LC3细胞 PERK RNA干扰 shRNA 内质网应激 共聚焦显微镜 自噬 雨蛙素 毒胡萝卜素
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R576
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 中英文缩略词表12-14
• 前言14-18
• 第一部分 稳定表达EGFP-LC3的AR42J细胞系的建立18-34
• 一、材料和方法18-26
• 二、实验结果26-31
• 三、讨论31-34
• 第二部分 靶向干扰PERK基因的sh RNA真核表达载体的构建及对AR42J-LC3细胞的靶向干扰效果34-49
• 一、材料和方法34-41
• 二、实验结果41-47
• 三、讨论47-49
• 第三部分 内质网应激状态下对雨蛙素诱导的急性胰腺炎细胞模型中自噬的影响49-57
• 一、材料和方法49-52
• 二、实验结果52-55
• 三、讨论55-57
• 全文总结57-58
• 全文参考文献58-63
• 综述63-73
• 参考文献70-73
• 在读期间发表论文73
• 参与科研项目73
• 在读期间获奖情况73-74
• 致谢74

【共引文献】

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1 吴婷;林珊珊;;抵抗素在伴高脂血症性急性坏死性胰腺炎大鼠发病中的作用[J];福建医科大学学报;2014年01期

2 刘杰锋;何志国;陈澍;余铖;廖洁;何子超;;早期肠内营养辅助治疗重症胰腺炎的临床疗效分析[J];现代生物医学进展;2013年27期

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1 张大鹏;中西医结合治疗重症急性胰腺炎的疗效评价[D];天津医科大学;2011年

2 张大兴;GSK-3β抑制剂LiCl对重症急性胰腺炎大鼠肝脏损伤的保护作用及其机制的研究[D];武汉大学;2014年

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1 张经文;肠道屏障在重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的作用及中西药物干预的实验研究[D];大连医科大学;2012年

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4 杨璇;早期测定血清B7-H3在急性胰腺炎中的临床意义[D];苏州大学;2013年

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6 郭徽;基于肺与大肠相表里研究电针促进胰腺炎大鼠胃肠动力以减轻急性肺损伤的机理[D];成都中医药大学;2013年

7 陈永欣;满天星异荭草苷对四氯化碳诱导大鼠肝纤维化的保护作用及其机制研究[D];广西医科大学;2014年

8 徐红燕;ICAM-1、NF-kB在大鼠高脂血症相关性胰腺炎微循环障碍中的研究[D];皖南医学院;2013年

9 林珊珊;抵抗素在伴高脂血症性急性坏死性胰腺炎大鼠发病中的作用[D];福建医科大学;2014年

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本文编号：272705