经IL-10基因转化的大肠杆菌治疗小鼠结肠炎的实验研究

发布时间：2020-06-26 21:56

【摘要】：第一部分IL-10基因转化大肠杆菌的研究目的：利用小鼠白介素-10基因转化大肠杆菌,使所转化的细菌表达并分泌IL-10。方法：根据mIL-10的基因序列及大肠杆菌载体的多克隆位点,经过优化修饰mIL-10基因序列,合成新mIL-10编码基因序列,连接至原核表达载体pET32a+并测序,EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定目的基因片段的大小。用基因工程技术将含有mIL-10基因序列的pET32a+/mIL-10克隆到原核表达载体Origami B(DE3),在体外经IPTG诱导表达,选择最佳的诱导条件。Western blot对目的蛋白进行鉴定,并探讨IL-10对LPS所诱导RAW264.7激活的抑制作用。结果：优化的mIL-10基因序列在氨基酸翻译上同源性为100%,重组的原核表达载体OrigamiB (DE3)/pET32a+mIL-10在体外可以高效表达,最佳的诱导时间为IPTG 1mmol诱导3小时表达量最大,细菌培养基中可检测目的蛋白的表达,浓度为3.96ng/ml。Western blot检测目的蛋白具有良好的抗原反应性,IL-10能够有效抑制LPS对RAW264.7的激活作用,减少TNF的释放。结论：mIL-10转化大肠杆菌能表达具有生物学效应的IL-10。第二部分IL-10基因转化的大肠杆菌对小鼠结肠炎的治疗研究目的：研究经IL-10基因转化的大肠杆菌对DSS小鼠结肠炎肠道炎症的影响,并探讨其相关机制。方法：将IL-10基因转化的大肠杆菌简称为E.coli-IL-10,空质粒转化菌则简称为E.coli0;将小鼠随机分成6组：正常组对照组,DSS组,DSS+E.coli/IL-10组,DSS+E.coli0组,正常鼠+E.coli/IL-10组以及正常鼠+E.coli组。建立小鼠急性DSS结肠炎模型。自小鼠模型建立第1天开始,DSS+E.coli/IL-10组和正常鼠+E.coli/IL-10分别给予重组IL-10大肠杆菌1×108cfu/天灌胃至实验结束,DSS+E.coli和正常鼠+E.coli分别给予空质粒大肠杆菌灌胃至实验结束,正常对照组以及DSS组给于同等培养基灌胃至实验结束。每天观察各组疾病活动指数(DAI),并在实验结束后检测各组小鼠炎症肠段肿瘤坏死因子(TNF)和髓过氧化物酶(MPO)等的含量,并测定小鼠结肠核因子(NF)-KB P65表达。结果： 1.DAI评分：DSS-E.coli/IL-10组小鼠的DAI评分与DSS组和DSS-E.coli0两组相比得分明显较低(P0.05), DSS-Ecoli0组与DSS组之间DAI得分无明显差异(P0.05)；对照组与正常鼠+Ecoli0、正常鼠+Ecoli/IL-10间3组DAI得分均为0。 2.组织学评分：DSS-Ecoli/IL-10 (6.22±3.30)低于DSS组和DSS-Ecoli0[(10.54±4.15)和(10.0±3.00)](P0.05),后两者直接得分无统计学差异(P0.05)；饮用DSS水各组均高于对照组(0.88±0.31)(P0.05)。 3.MPO活性：DSS+E.coli/IL-10组(2.35±0.39)明显低于DSS组和DSS+Ecoli0组[(4.15±0.77)和(3.5±1.23)](P0.05),高于其他3组(P0.05)。 4.组织匀浆TNF含量：DSS组(237.85±47.01)与DSS-Ecoli0(239.81±50.38)组之间无明显差异(P0.05),高于其他4组(P0.05)；DSS-Ecoli/IL-10组(172.46±66.71)低于DSS组以及DSS-Ecoli0(?)且(P0.05),高于对照组(P0.05)。 5.结肠粘膜NF-kB表达：DSS-Ecoli/IL-10组小鼠粘膜中NF-kB的活性明显低于DSS组和DSS-Ecoli0组(P0.05),饮用DSS水的3组小鼠的粘膜NF-kB活性明显比饮用自来水的3组小鼠活性高,DSS组与DSS-Ecoli0两组间NF-kB活性无显著差异(P0.05)。结论：利用经IL-10基因转化的大肠杆菌可以明显缓解DSS小鼠的结肠炎症损伤,减低MPO活性、抑制炎症肠段炎症细胞NF-kB的活化及炎性细胞因子的分泌。利用基因工程技术结合肠道共栖菌表达IL-10可以为IBD治疗提供一个新的方法。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R574.62
【图文】：

序列,无碱,合成基因,检测报告

图3.mlL一10全基因合成测序报告检测报告显示，所合成基因序列与预期设定的基因序列同源性100%，无碱基对错一误。1.2请北京三博远志公司合成并连接于pET32a载体，测序结果如下(祥见附录l):TGATATCGGATCCGAATTCATGCCAGGTAGCGCGCTGCTGTGCTGCCTGCTGCTGCTGACCGGCATGCGTATCTCCCGTGGCCAGTACAGCCGTGAGGATAACAACTGCACCCATTTCCCGGTTGGTCAGAGCCACATGCTGCTGGAACTGCGTACTGCGTTCAGTCAGGTTAAAACCTTCTTTCAGACCAAAGATCAGCTGGACAATATCTTACTCACCGATTCTCTGATGCAGGATTTCAAAGGCTACCTGGGTTGCCAGGCTCTGTCTGAGATGATCCAGTTCTATCTGGTGGAGGTTATGCCGCAGGCCGAGAAACACGGCCCAGAAATTAAAGAACATCTGAACTCACTCGGTGAGAAACTGAAAACTCTGCGTATGCGCCTGCGTCGTTGCCATCGTTTTCTGCCTTGTGAGAATAAATCTAAGGCGGTTGAACAGGTGAAATCAGATTTCAACAAACTGCAGGACCAAGGCGTTTACAAAGCTATGAACGAATTCGATATTTTCATCAACTGTATTGAAGCATACATGATGATCAAGATGAAATCTTAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGT

电泳图,表达质粒,酶切鉴定,电泳图

IL一10经双酶切产物;2):pET32ajmll一1组pET犯叭L一ro表达质粒酶切鉴定电泳质粒经酶切反应后，产物用3%琼左右出现一条带，与所插入的小鼠鉴定重组质粒构建成功。表达的诱导表达影响5.不同诱导时间对mIL一10表达影响3J组5ET32a/IL一10/OrigamiB(DE3)inducing

【参考文献】