血管紧张素Ⅱ相关基因BC097361的克隆表达及多克隆抗体的制备

发布时间：2020-07-14 15:49

【摘要】： 目的: 构建血管紧张素Ⅱ相关新基因BC097361的原核表达载体,诱导BC097361基因的融合蛋白表达,并对其进行纯化,制备兔抗BC097361融合蛋白多克隆抗体并进行鉴定,从而探讨该基因在肝纤维化发生中的作用。方法: 1.应用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription PCR,RT-PCR)技术,以大鼠肝星状细胞系LX02细胞提取的总RNA为模板,扩增目的基因BC097361,克隆至pGEM-T载体,测序正确后将目的基因插入原核表达载体pET-32a(+)中,并使其与载体中的His标签在同一读码框内,转化大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导融合蛋白表达,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析、免疫印迹Western blotting分析证实融合蛋白表达的特异性。再利用亲和层析法对表达蛋白进行纯化及柱上复性。 2.纯化的His-BC097361融合蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗该融合蛋白的多克隆抗体。以纯化的融合蛋白为抗原,同时以免疫前后的兔血清作为一抗,利用Western blotting技术和ELISA方法对多克隆抗体进行特异性和效价检测。 3.选用鉴定正确的多克隆抗体以免疫组织化学方法和Western blotting方法分别检测BC097361蛋白在大鼠肝纤维化组织中的表达以及分析在血管紧张素Ⅱ刺激下LX02细胞中BC097361相关蛋白的表达。结果: 1.成功构建BC097361的原核表达载体pET-32a(+)-BC097361,转化BL21表达菌,IPTG诱导表达BC097361融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting分析得到证实。 2.纯化BC097361融合蛋白并成功制备兔抗BC097361多克隆抗体。ELISA检测证实该抗体效价＞1:320000,Western blotting、免疫组织化学检测证明该抗体有较好的特异性。 3.利用多克隆抗体行Western blotting检测及免疫组织化学技术证实:血管紧张素Ⅱ作用的LX02细胞及大鼠肝纤维化组织中BC097361相关蛋白表达明显上调。结论: 1.利用大肠埃希菌BL21(DE3)可以成功表达BC097361蛋白。 2.纯化的BC097361融合蛋白免疫新西兰兔,获得高特异性、高效价多克隆抗体,为今后研究该蛋白的生物学特性奠定了基础。 3.血管紧张素Ⅱ作用的LX02细胞和大鼠肝纤维化组织中均可检测到BC097361蛋白的表达明显增加。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R575.2
【图文】：

电泳图谱,细胞,琼脂糖凝胶电泳,重组质粒

A260/A280二2.01，非刺激组浓度2397.0657召g/ml， A26o/A280=2.04，l%琼脂糖凝胶电泳可见总RNA为285、185、55三条目的带，证实总RNA质量完全满足进行反转录条件的要求(图1一2)。2.目的基因BC097361的扩增以逆转录合成LX02细胞cDNA为模板进行BC097361序列的扩增，扩增产物行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪下观察结果并拍照(图1一3)，结果可见显示清晰的目的条带，大小约 897bp。2000bPIO00bP750bP500bP250bPIO0bP2000bP1000bP750bP500bP897bP250bP100bP图1一ZmRNA电泳图谱1:未刺激的LX02细胞 2:Ang11刺激36h的LXoZ细胞 M:DNAmarker图1一 3BCO97361基因PCR扩增图 l:BC097361PCR扩增结果 M:DNAmarker3.成功构建pE不32a(+)一BCo97361重组质粒pGEM一T-BCo97361重组质粒双酶切(EcoRI和 Hind111)后，得到预期大小 897bp的目的片段(图1一4)，并连接到用相同的EcoRI和HindJJJ酶切的pET-32a(+)中，转化大肠埃希菌BLZI感受态，提取质粒后再次酶切鉴定结果正确(两条带分别为5881bP和897bp)(图1一5)

电泳图,重组质粒,双酶,电图

pGEM一T-Bco97361重组质粒双酶切电图1一5pE下犯a(+)一BCo97361重组表达质粒双酶

洗涤液,液洗,二次,包涵体

50KD图1一 8pET-32a(+)一BCo97361重组菌大量诱导后分次洗涤结果l:pE下32a(+)一BCo97361非诱导组2:pE下32a(+)一Beo97361大量诱导组3:a(pE不犯a(+)一Beo97361大量诱导超声碎菌后上清)4:bl(洗涤液洗涤一次后上清)5:b2(洗涤液洗涤二次后上清)6:b3(洗涤液洗涤三次后上清)7:cl(ddHZO液洗涤一次后上清)8:eZ(ddHZO液洗涤二次后上清)9:d(8M腮溶解包涵体离心后上清)10:Marker(标准同前)

【参考文献】