非酒精性脂肪肝病的发病机制及重组腺病毒介导DN-JNK1对其发病的治疗作用

发布时间：2020-07-15 03:35

【摘要】： 目的：高脂饲料喂养SD大鼠构建非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)模型,动态观察NAFLD大鼠血清学和肝匀浆指标、IR及肝组织病理改变等指标的变化。方法：雄性SD大鼠192只,随机分为对照组(NG)和高脂组(HG)各96只,对照组喂饲普通饲料,高脂组喂饲高脂饲料。于第1周(w)开始、第2、4、8、12、16w末随机从各组抽取16只大鼠,其中8只行正糖高胰岛素钳夹实验技术检测葡萄糖输注率(GIR),另8只测量体重、肝指数,门静脉采血予以生物化学法检测空腹血糖(FBS)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)；放射免疫法检测空腹胰岛素(FIns)、肿瘤坏死因子a (TNF-a);分光光度计检测游离脂肪酸(FFAs);制备肝匀浆分光光度计测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；大鼠肝组织行HE染色和苏丹Ⅳ染色,光镜下对肝脏脂肪变性情况进行评定。结果：与同期NG比较：HG大鼠体重、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、FIns、FFAs、TNF-a及肝匀浆MDA在第8、12、16w末均明显升高,肝匀浆SOD水平则降低,差异均具有统计学意义(p值均0.05)HG各组间两两比较：在第8、12、16w末随着高脂饲料喂养时间的延长,除肝匀浆SOD水平逐渐降低外,肝指数、血清各项指标及肝匀浆MDA水平均逐渐升高,差异均具有统计学意义(p值均0.05)。与同期NG比较,在第4、8、12、16w末,HG大鼠的GIR水平降低；HG各组间两两比较,差异均具有统计学意义(p值均0.05)。肝组织病理学检查显示HG大鼠第8w末形成单纯性脂肪肝,随着喂养时间的延长,HG大鼠肝细胞脂肪变性逐渐加重,第12w末形成了非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis, NASH)。结论：高脂饮食喂饲SD大鼠8w成功构建单纯性脂肪肝模型,12w可形成NASH模型；肝脏脂肪沉积,TNF-α、FFAs.氧化应激反应都参与了NAFLD的发生发展；IR出现在肝脏脂肪变性之前,IR可能是NAFLD发病的始动因素。第二部分动态研究非酒精性脂肪肝病中JNK1蛋白表达及其对胰岛素信号通路的影响目的：动态观察非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease, NAFLD)中c-jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase-1,JNK1)蛋白表达及其对胰岛素(Insulin, INS)信号通路的影响,探讨JNK1、INS信号通路蛋白变化及其与IR和NAFLD的关系。方法：雄性SD大鼠192只,随机分为对照组(NG)和高脂组(HG)每组各96只,对照组喂饲普通饲料,高脂组喂饲高脂饲料。于第1周(w)开始、第2、4、8、12、16w末随机从各组抽取8只大鼠,处死后取肝组织行Western blot检测JNKl、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、胰岛素受体底物1丝氨酸307磷酸化(phospho-IRS-1 Ser307,p-IRS-1Ser307)、蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)、蛋白激酶B丝氨酸473磷酸化(phospho-PKBSer473,p-PKBSer473)水平。结果：第2、4、8、12、16w末,HG与同期NG比较：肝组织JNK1蛋白表达、p-IRS1Ser307水平增高,p-PKBSer473水平降低；HG各组间上述各项指标比较,从第2w末开始,随着时间的延长,除p-PKBSer473水平逐渐降低外,JNK1蛋白表达及p-IRS1Ser307水平均逐渐升高,差异均具有统计学意义(p值均0.05)。NG各组间比较JNK1蛋白表达、p-IRS1Ser307和p-PKBSer473水平,差异均无统计学意义(p值均0.05)。各组间两两比较IRS-1和PKB蛋白表达,差异均无统计学意义(p值均0.05)。JNK1的蛋白表达强度与IR呈正相关(Pearson相关系数为0.931,p值0.01)。结论：高脂饮食可诱导肝组织JNK1蛋白表达增高,增加的JNK1结合IRS-1后可以上调p-IRS-1Ser307水平,下调p-PKBSer473水平,从而干扰INS信号传导,导致IR,引起NAFLD; TNF-α、FFAs、氧化应激反应通过促进JNK1活性增强,进一步加重IR从而参与NAFLD的发生发展过程；肝组织的R出现在全身IR和肝脏脂肪变性之前,IR可能是NAFLD发病的启动因素。第三部分应用表达DN-JNK1的重组腺病毒治疗SD大鼠非酒精性脂肪肝病及其机制研究目的：应用表达失活型c-jun氨基末端激酶1的重组腺病毒(recombinant adenovirus expressing adenovirus expressing dominant negative type c-Jun N-terminal kinase1, Ad-DN-JNK1)治疗SD大鼠非酒精性脂肪肝病(non alcoholic fatty liver disease, NAFLD),探讨其对NAFLD的治疗作用及作用机制。方法：雄性SD大鼠96只,随机分为对照组(NG)32只、高脂组(HG)64只,对照组喂饲普通饲料,高脂组喂饲高脂饲料。于第8周(w)末随机从各组抽取16只大鼠,其中8只行正糖高胰岛素钳夹实验技术(钳夹技术)检测葡萄糖输注率(GIR),另8只门静脉抽血和肝组织病理切片鉴定成模后,将余下的16只对照组大鼠继续喂饲普通饲料至12w末称为12w对照组(NG12w)；余下的高脂组大鼠随机分为12w高脂组(HG12w),携带绿色荧光蛋白的腺病毒(Ad-GFP)组和Ad-DN-JNK1组,各组均16只,此3组均喂饲高脂饲料至12w末。第8w末,NG12w和HG12w大鼠均从尾静脉注入1ml生理盐水作为安慰剂对照,Ad-GFP组大鼠尾静脉注入1ml2.5×1010pfu的Ad-GFP作为腺病毒对照,Ad-DN-JNK1组大鼠尾静脉注入1ml 2.5×1010pfu的Ad-DN-JNK1作为治疗组。12w末随机从各组抽取8只大鼠行钳夹技术检测胰岛素抵抗(IR)情况,各组余下8只大鼠门静脉采血生物化学法检测空腹血糖(FBS)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)；放射免疫法检测空腹胰岛素(FIns)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a),分光光度计测定游离脂肪酸(FFAs);制备肝匀浆测定TG、TC、FFAs(检测方法同上),分光光度计法检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)；另取部分肝组织行Western Blot技术检测肝组织c-jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase-1, JNK1)、胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate-1,IRS-1)、蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)蛋白表达和胰岛素受体底物1丝氨酸307磷酸化(phospho-IRS-1 Ser307,p-IRS-1 Ser307)、蛋白激酶B丝氨酸473磷酸化(phospho-PKBSer473,p-PKBSer473)水平。部分肝组织行HE染色、苏丹Ⅳ染色,光镜下评定肝脏脂肪变性情况。结果：第8w末高脂组大鼠已构建成单纯性脂肪肝IR模型。与NG12w大鼠比较,HG12w和Ad-GFP组的体重、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、FFAs、FIns、TNF-a及肝匀浆TG、TC、FFAs、MDA均明显升高,肝匀浆SOD降低；葡萄糖输注率(GIR)降低；肝组织JNK1蛋白表达、p-IRS-1Ser307水平增高,p-PKBSer473水平降低,差异均具有统计学意义(p值均0.05)。Ad-DN-JNK1组与HG12w及Ad-GFP组大鼠分别比较上述各项指标,Ad-DN-JNK1组的体重、肝指数、血清ALT、AST、TG、TC、FFAs、FIns、TNF-a及肝匀浆TG、TC、FFAs、MDA均明显降低,肝匀浆SOD升高；GIR升高；肝组织JNK1蛋白表达、p-IRSlSer307水平降低,p-PKBSer473水平升高,差异均具有统计学意义(p值均0.05)。Ad-DN-JNK1组与NG12w组比较,体重、肝指数、AST、FIns、GIR水平、JNK1蛋白表达、p-IRS1Ser307、p-PKBser473水平差异均无统计学意义(p值均0.05),其余血清学及肝匀浆指标差异均具有统计学意义(p值均0.05)。各组间两两比较IRS-1和PKB蛋白表达,差异均无统计学意义；HG12w与Ad-GFP组比较血清和肝匀浆各项指标以及JNK1、INS信号通路蛋白表达及磷酸化水平,差异均无统计学意义(p值均0.05)。HG12w及Ad-GFP组大鼠均进展为非酒精性脂肪性肝炎(non alcoholic steatohepatitis, NASH);而Ad-DN-JNK1组大鼠肝脏脂肪变性明显改善,未出现炎症反应。结论：腺病毒载体是安全有效的基因治疗载体,应用Ad-DN-JNK1治疗SD大鼠NAFLD,可明显改善NAFLD,其作用机制可能为：Ad-DN-JNK1抑制JNK1活性后,下调p-IRS-1Ser307水平,升高其下游p-PKBSer473水平,进而促进INS信号传导,减弱IR,并降低TNF-α、FFAs水平,减少氧化应激反应,减轻肥胖和肝脏脂肪变性,最终改善NAFLD。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.5
【图文】：

不Sw来HG大盆扦组奴切片苏丹N挽色(400x)

蛋白表达,信号通路,两两比较,不同时期

表达和p·IRs一l知07、P-pKB洲73水平，差异均无统计学意义(p值均 >0.05)。各组间两两比较IRS一1和PKB蛋白表达，差异均无统计学意义(p值均 >0.05)，见图2一1至24。鹅HGZ，HG4，HG日，HG12，HG16，JN【1哪哪粉{娜翻脚辉茸娜徽甲明娜降绷脚户一今沙…46kdP-IRS一15.，，.，17OkdIRS一1170七dP-P【广t弓7

大鼠肝组织,蛋白表达,不同时期,肝组织

卜侧侧奥铸蓄炸粤0阶﨑男甲s国曰奴图2一3各组不同时期大鼠肝组织p.IRs一lser307水平注:与同期NG比较知 <0.05;HG各组间比较与 <0.05.lw.2，04份口8份.12w.16w卜内奥书侧侧蓄斗妞!﨑钻留么图2一4各组不同时期大鼠肝组织p一P拙旋r4”水平注:与同期NG比较知<0.05;HG各组间比较乍 <0.052.3.2肝组织JNKI蛋白表达与lR水平相关性分析将HG大鼠第4w、行相关性分析后发现:sw、12w、16w末的GIR与肝组织JNKI蛋白相对灰度值进GIR与JNKI蛋白表达呈明显负相关(Pearson相关系数为0.931，P<0.01);即JNKI蛋白表达与IR水平呈正相关。

【参考文献】