腺病毒介导的炎性基因miRNAs干预小鼠暴发性肝炎和裸鼠人肝癌皮下移植瘤的研究

发布时间：2020-07-18 07:39

【摘要】：[背景及目的] 我国是乙肝病毒(HBV)感染高发地区,2006年我国乙肝流行病学调查显示,目前我国1-59岁乙肝表面抗原(HbsAg)人群携带率为7.18%,儿童(5岁以下)HBsAg携带率为0.96%,据此估算,目前我国HBV慢性感染者约9300万人,其中约2000万患者为慢性乙肝。慢性乙肝患者中约1%发展为重型肝炎。由于多种原因所致肝细胞大量坏死,导致肝脏合成、代谢、生物转化、解毒、排泄等功能发生严重障碍,并出现肝性脑病、脑水肿、感染、出血等严重并发症的临床综合征称之为重型肝炎或肝功能衰竭,是目前临床常见的急危重症。在欧美国家,药物及酒精是引起重型肝炎的主要原因,在我国,重型肝炎则主要由肝炎病毒,尤其是HBV感染所致(约70%)。重型肝炎来势凶险、病情严重、发展迅速、病死率高,严重威胁患者生命。重型肝炎的发病机制尚未明了,目前临床上仍缺乏有效治疗手段,虽然部分患者可通过肝移植手术挽救生命,但移植后1年生存率也仅为50%-60%,因此绝大部分重型肝炎患者预后不良,死亡率可达到70%-80%。开发与重型肝炎发生、发展相关的基因治疗的方法正成为该领域的研究热点和发展方向。原发性肝癌是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤,居恶性肿瘤发生率的第五位、病死率的第三位。全世界每年约有65万人死于肝癌。全世界80%以上的肝癌患者集中在亚洲和非洲,其中中国占了约50%。在中国,肝癌多由乙肝所致肝硬化演变而来,而在西方国家,由于HCV感染和非酒精性脂肪肝患者的增加使得肝癌的发病率逐年增加。传统的肝癌治疗手段包括外科切除、肝移植、放疗和化疗。然而,无论是手术切除还是肝移植均存在着术后的高复发率问题,且肝移植供体贫乏,加之肝细胞癌对化疗和放疗均不敏感,使得肝癌的临床诊疗仍缺乏有效的治疗手段。因此,针对肝癌诊治新技术、新疗法如基因治疗和分子靶向治疗的研究则显得尤为重要和迫切。在重型肝炎的发病过程中,涉及到多种炎性分子的异常表达,如Fas/FasL系统、TNFa/TNFR1系统介导的肝细胞凋亡和fgl2介导的肝细胞坏死。在重型肝炎时,体内残存的肝细胞过度表达Fas,同时大量激活的CTL异常高表达FasL,且血清可溶性FasL水平显著增高,从而导致肝细胞凋亡。TNFa由活化的巨噬细胞产生,它有两种受体,即TNFR1和TNFR2,有研究表明,TNFa及TNFR1的表达水平与重型肝炎的病变程度相一致,同时凋亡的肝细胞数目与TNFa的表达呈现非常显著的正相关。Fgl2凝血酶原酶被称为“免疫凝血”,它具有免疫调节功能和凝血功能。作为新型凝血酶原酶,fgl2可直接促进凝血酶的生成而不依赖于其它凝血因子,凝血酶可通过降解纤维蛋白原形成纤维蛋白导致血栓形成和纤维素的沉积。研究揭示在IFN-y等炎性因子的刺激下,fgl2在重型肝炎中高表达,是肝细胞坏死的重要分子机制；本研究所前期利用mfgl2反义质粒和shRNA干扰质粒可显著减轻暴发性肝炎小鼠肝组织病理损伤,减少炎性细胞的浸润、纤维素的沉积,从而提高暴肝小鼠生存率至33.3%。 Fgl2与肝癌的发生、发展也有密切关系。我们的前期研究发现常见实体肿瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的实质细胞、间质浸润细胞、血管内皮细胞及细胞外基质均有fgl2凝血酶原酶的广泛表达,并与纤维蛋白沉积有密切组织学关系。作为凝血酶的上游基因,我们推测fgl2在肿瘤生长、转移及血管新生中亦发挥了重要作用。我们应用裸鼠角膜血管新生模型和肿瘤皮下瘤移植模型显示fgl2基因沉寂后的人肝癌细胞诱导血管新生的能力显著降低；Fgl2敲除的高侵袭性人肝癌细胞HCCLM6细胞增殖能力、侵袭能力,耐受TNFa诱导的凋亡能力、表达促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力较未干扰HCCLM6细胞及非相关对照HCCLM6细胞均显著下降,表明fgl2在肿瘤细胞中的高表达在肿瘤的生长和转移中发挥了重要作用。进一步研究表明：分泌型fgl2在肿瘤微环境中的表达上调通过激活p38-MAPK通路和抑制JNK通路实现。上述变化可增强单核巨噬细胞的致炎活性,抑制向树突状细胞分化,继而可能抑制肿瘤特异性T细胞免疫；而膜结合型fgl2在单核巨噬细胞的表达则可能通过活化p38-MAPK和ERK途径促进细胞的增殖。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指内源性或外源性双链RNA (dsRNA)分子降解相应序列的mRNA,导致靶基因表达沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默,具有高效、特异、快速等优点。作为一种自然防御机制,RNA干扰在许多物种如线虫、果蝇、植物以及哺乳动物中都存在,可防止生物体受到病毒或其它外源核酸的入侵,同时在生物生长发育中发挥着基因表达调控的作用。目前发现有两种非编码小干扰RNA：小的干涉RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA). RNA干扰现象被发现以后,越来越多的研究者将其广泛应用于功能基因组学的研究。近年来,RNA干扰技术作为一种治疗工具,在预防和治疗人类疾病如感染性疾病、肿瘤、某些代谢性疾病等方面也取得了瞩目的成绩。本研究旨在利用miRNA技术干预在重型肝炎、肝癌发生发展中起重要作用的致病基因,研究基因治疗的可行性,为重型肝炎、肝癌的防治开辟出新方法。具体研究内容如下： 1、针对与重型病毒性肝炎发生发展密切相关的分子mfgl2,构建腺病毒介导的miRNA即Ad-mfgl2-miRNA,探索其对目的基因的沉默效应以及联合应用(Ad-mfgl2-miRNA、Ad-mFas-mTNFR1-miRNA)对暴发性肝炎小鼠病程的干预作用； 2、利用Ad-hfgl2-miRNA沉默肝癌中高表达的fgl2,观察其对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的靶向干预作用。 [研究方法] 1、通过Gateway技术构建产生小鼠fg12-miRNA的表达载体P-mfgl2-miRNA和非相关对照质粒,分别连入5型缺陷型腺病毒载体中,形成Ad-mfgl2-miRNA和Ad-neg-miRNA。细胞水平共转染Ad-mfgl2-miRNA和pcDNA3.1-mfg12表达质粒,通过实时荧光定量PCR及Western blot观察fgl2在基因转录水平及蛋白水平表达量的改变。 2、建立MHV-3诱导的Balb/cJ小鼠暴发性肝炎模型；通过尾静脉注射将Ad-mfg12-miRNA和／或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA(实验室保存)导入小鼠体内,取小鼠眼球血检测血清生化学指标的改变、肝组织HE染色检测小鼠肝组织病理变化,并观察暴发性肝炎小鼠生存率的变化；通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组化检测各组小鼠肝组织中目的基因的表达情况；通过TUNNEL法检测各组小鼠肝组织中肝细胞凋亡情况。 3、建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-hfg12-miRNA(实验室保存),优化治疗剂量；观察裸鼠皮下瘤的动态生长变化,计算相对肿瘤增殖率；通过实时荧光定量PCR和Western blot检测瘤组织中fgl2的表达,免疫组化检测瘤组织中fgl2、纤维蛋白以及血管新生标志物CD31的表达,并计算瘤组织中微血管密度。 [结果] 1、成功构建了腺病毒介导的针对小鼠fgl2的miRNA和非相关对照miRNA,测序鉴定无误。在CHO细胞中,干预组fgl2在RNA水平及蛋白水平的表达均较非相关对照组和阳性对照组显著降低。 2、尾静脉注射Ad-mfg12-miRNA或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA后,可使暴发性肝炎小鼠生存率从0分别提高到38.9%和16.7%,而上述两种腺病毒联合干预后的暴肝小鼠生存率可提高到44.4%。干预组小鼠均可见肝组织病理学变化和血清学指标的明显改善；小鼠肝组织中相应靶基因的表达和肝细胞凋亡在干预组受到明显抑制。 3、经Ad-hfg12-miRNA处理后,干预组小鼠的整体状态好于非相关对照组和空白对照组小鼠,瘤块明显小于后两组小鼠的瘤块。与非相关对照及空白对照相比,其相对肿瘤增殖率分别达到29.9%和36.7%,同时,也检测到了注射腺病毒注射液后,受体组织肿瘤细胞中hfg12 mRNA水平和蛋白质水平均出现了抑制,证实了Ad-hfg12-miRNA对hfg12凝血酶原酶基因的沉默作用,此外,瘤组织中纤维蛋白沉积及新生血管也较对照组明显降低。 [结论] 1、本研究成功构建了Ad-mfg12-miRNA,体内外实验均观察到其高效特异的下调目的基因表达的作用。 2、本研究表明fgl2、Fas及TNFR1可作为重型肝炎基因治疗的靶点,基于重型肝炎相关基因的体内联合干预较单独干预显示出了更为显著的治疗效果,利用miRNA沉默fgl2、Fas及TNFR1基因为重型肝炎的治疗提供了新的策略。 3、本研究显示Ad-hfg12-miRNA可显著抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤生长,干预效果明显,为今后肝癌等恶性肿瘤的治疗提供了新思路。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R575.1;R735.7

【参考文献】