CTGF和TIMP-1shRNA表达质粒共转染对肝星状细胞细胞因子及细胞外基质分泌的影响

发布时间：2020-07-21 09:55

【摘要】： 目的：研究结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor,CTGF)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1 (Tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒重组体分别转染及共转染肝星状细胞(Hepatic stellate cell T6,HSC-T6)后CTGF、TIMP-1、procol-α1 mRNA基因表达及细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)分泌的影响,来探索肝纤维化的发生机制。方法：将已筛选并成功构建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干扰靶位的shRNA表达质粒重组体,以转染试剂Lipfectamine 2000分别及共转染经TGF-β1刺激活化的大鼠HSC-T6,另设空质粒组、只加转染试剂组及空白对照组,每组6复孔,流式细胞仪分析转染效率；36h后抽提RNA并逆转录成cDNA通过荧光定量PCR检测各组细胞中CTGF/TIMP-1、procol-α1 mRNA的表达；放射免疫法(Radioimmunoassay, RIA)分析细胞上清液中Ⅲ型前胶原(Procollagentype-Ⅲ,PCⅢ)、透明质酸(Hexadecenoic acid, HA)和层粘连蛋白(laminin, LN)的含量。结果：与空白对照组相比,空质粒对照组、只加转染试剂组对基因表达及ECM的分泌均无影响,而CTGFshRNA和TIMP-1 shRNA能明显抑制CTGF、TIMP-1、procol-α1 mRNA的表达,降低上清液中PCⅢ、HA和LN的含量,双重组质粒共转染HSC-T6后其对procol-α1 mRNA和ECM的抑制程度优于单重组质粒转染(P0.01或P0.05)。结论：1.CTGFshRNA、TIMP-1shRNA可明显抑制HSC的CTGF、TIMP-1、procol-α1基因表达及ECM的分泌,且联合干扰较单独干扰效果更强。2.多基因共转染作为抗纤维化基因治疗的方法,其治疗效果可能会优于单基因转染。
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R575.2
【图文】：

1细胞形态变化及转染效率在普通倒置显微镜下见A组细胞轮廓清晰、平滑、细胞透亮、生长状态好(图1)。而转染组(B、C、D、E和F组)细胞生长状态差，细胞出现皱缩、形态变圆、与邻近细胞分离、细胞漂浮增多等改变(图2);荧光显微镜下观察:A、B组细胞无荧光显示，C、D、E、F组均有荧光显示;流式细胞仪检测发现A、B组细胞中均无荧光蛋白的表达，C、D、E、F组中可测到荧光蛋白的表达(图3，图4)，36h质粒转染效率见表2，C、D、E、F组组间差异无显著性(尸>0.05)，说明质粒转染效率基本相同，排除质粒转染效率的不同而对实验结果的影响。表5流式细胞仪检测细胞转染效率(%)几 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C组D

在普通倒置显微镜下见A组细胞轮廓清晰、平滑、细胞透亮、生长状态好(图1)。而转染组(B、C、D、E和F组)细胞生长状态差，细胞出现皱缩、形态变圆、与邻近细胞分离、细胞漂浮增多等改变(图2);荧光显微镜下观察:A、B组细胞无荧光显示，C、D、E、F组均有荧光显示;流式细胞仪检测发现A、B组细胞中均无荧光蛋白的表达，C、D、E、F组中可测到荧光蛋白的表达(图3，图4)，36h质粒转染效率见表2，C、D、E、F组组间差异无显著性(尸>0.05)，说明质粒转染效率基本相同，排除质粒转染效率的不同而对实验结果的影响。表5流式细胞仪检测细胞转染效率(%)几 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C组D组E组F组HSC一 T625.9士 1.622.5士 1.821.8士 1.222.3士1.2注:C、D、E、F组间比较(P>0.05)图1正常细胞在光镜下形态xloo Figlnormaleellslight

微镜下观察:A、B组细胞无荧光显示，C、D、E、F组均有荧光显示;流式细胞仪检测发现A、B组细胞中均无荧光蛋白的表达，C、D、E、F组中可测到荧光蛋白的表达(图3，图4)，36h质粒转染效率见表2，C、D、E、F组组间差异无显著性(尸>0.05)，说明质粒转染效率基本相同，排除质粒转染效率的不同而对实验结果的影响。表5流式细胞仪检测细胞转染效率(%)几 ble5Floweytometryeelltransfectioneffieieney(%)C组D组E组F组HSC一 T625.9士 1.622.5士 1.821.8士 1.222.3士1.2注:C、D、E、F组间比较(P>0.05)图1正常细胞在光镜下形态xloo Figlnormaleellslight mieroseopeX100图2转染36h后细胞在光镜下形态xloo FigZtransfeetionfor36hlight microscopeX100

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本文编号：2764256