caveolin-1在小鼠非酒精性脂肪性肝病中的作用研究

发布时间：2020-07-22 04:14

【摘要】：研究背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是以肝细胞脂肪变性和脂肪蓄积为病理特征,但无过量饮酒史且排除其他肝病的临床综合征,疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)、肝纤维化、脂肪性肝硬化等类型。该病平均累及世界总人口的25%-30%,在肥胖人群中的发病率更高,明显超过乙型肝炎、丙型肝炎及酒精性肝病的发病率,成为最常见的慢性肝病。近年来,随着人民生活水平的提高和生活方式的改变,我国的患病率呈逐年上升趋势。然而,NAFLD的具体病理机制尚不明确。既往的研究表明,NAFLD的发病机制与胰岛素抵抗(IR)有关,而近年来研究表明微囊蛋白-1(caveolin-1,cavl)和胰岛素抵抗有关,提示cavl可能在代谢性疾病中发挥作用。有研究表明,caV1过表达后能显著促进HepG2细胞摄取氧化性低密度脂蛋白而cavl低表达后能抑制HepG2细胞吸收长链3H油酸,提示cavl介导脂质吸收的作用可能促进NAFLD的形成。然而,cavl是否参与NAFLD的发生发展过程尚不明确。本文采用高脂高胆固醇饮食诱导建立C57BL/6小鼠NAFLD模型,通过qPCR、 Western blot、免疫组化检查等方法检测cavl在NAFLD小鼠肝脏中的mRNA、蛋白水平以及分布的变化,探讨cavl在NAFLD发病中的作用。目的本研究旨在通过观察患NAFLD的C57BL/6小鼠肝组织中cavl基因、蛋白与分布的变化,进而探讨其在脂肪肝病理生理机制中的作用。方法 1给予C57BL/6小鼠14周的高脂高胆固醇饲料,即标准饲料基础上添加15%的猪油和1.25%的胆固醇,建立NAFLD动物模型(实验组),而仅用标准饲料(脂肪4%,胆固醇0.02%)喂养的小鼠为对照组。NAFLD模型建立后行动物解剖,取血和肝组织以备检测。 2小鼠取血后,分离血清,检测两组小鼠血清中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇的浓度(LDL-C). 3从小鼠肝脏组织中提取RNA,然后进行逆转录,根据合成的cavl引物进行实时荧光定量PCR(SYBR法),对cavl的mRNA在两组小鼠中的变化进行相对定量分析。 4从小鼠肝脏组织中提取总蛋白,行Western Blot,观察实验组和对照组小鼠肝脏中cavl在蛋白水平的变化,进一步证实其变化是否与mRNA水平变化相对应。 5将小鼠肝脏组织用福尔马林固定,先做病理切片初步观察肝脏组织在对照组和实验组的变化；并将实验组小鼠进行脂变分度。 6将固定好的小鼠肝脏组织水化后进行免疫组化,进一步确定cavl在两组小鼠肝脏组织中的分布特点及其分布的变化。结果 1给予实验组小鼠14周的高脂高胆固醇饲料后,所有小鼠均患NAFLD. 2实验组小鼠血清总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇比对照组升高(TC:3.771±0.804mmol/L vs.1.940±0.300mmol/L, P0.01; HDL-C:2.224±0.428vs.1.120±0.066, P0.01; LDL-C:1.241±0.663vs.0.510±0.191, P0.01),而甘油三酯无统计学差异(0.719±0.383vs.0.710±0.487, P0.05). 3实验组小鼠肝组织cavl基因表达比对照组明显升高(1.536±0.226vs.0.980±0.272,P0.05)。 4Western Blot结果证实实验组小鼠肝组织cav1蛋白比对照组明显升高(0.643±0.240vs.0.100±0.130,P0.01),与其基因变化一致。 5实验组肝脏组织的病理结果显示脂肪肝存在,且5只小鼠为可疑非酒精性脂肪性肝炎(NASH),7只小鼠为非酒精性单纯性脂肪肝(NAFL). 6免疫组化结果显示cavl在实验组小鼠肝脏中的分布增加(0.251±0.0380vs.0.137±0.0003,P0.05),主要位于肝细胞膜、脂滴膜及胞浆中,比对照组中cavl在肝窦状区分布明显增加；cavl在肝组织中的表达增加随着脂肪肝严重程度的加剧而更加明显。结论本实验利用高脂高胆固醇饮食成功建立NAFLD小鼠模型,实验组小鼠血清中TC、HDL-C、LDL-C显著升高,肝组织cavl的基因及蛋白表达量显著增加,肝组织cavl分布增加,主要分布在肝细胞膜、脂滴膜及胞浆中,且cavl的表达强度与脂肪肝的程度有关,这些结果提示cavl在高脂高胆固醇饮食诱导的NAFLD中发挥一定的作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.5

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