人食管胃结合部平滑肌细胞原代培养及贲门失弛缓症患者腹段食管环行肌舒缩信号分子表达的初步研究

发布时间：2020-07-22 05:16

【摘要】：第一部分食管胃结合部平滑肌细胞原代培养及鉴定目的:探索最简单、有效的原代食管胃结合部平滑肌细胞培养方法并鉴定平滑肌细胞特有表型。方法:选取2015年1月至2017年10月在河北医科大学第四医院因中高位食管癌行食管大部切除术患者食管胃结合部平滑肌组织共24例,分别以酶消化法(enzymatic digestion with tissue blocks,ED)和组织块法(explant culture with tissue blocks,EC-T)进行平滑肌细胞原代培养。ED组中,消化酶选择胶原酶Ⅱ(collagenaseⅡ)和胰酶/EDTA消化液(Trypsin/EDTA),并以不同消化酶浓度结合不同消化温度和消化时间探索最佳获取原代细胞方法,记录每200倍镜视野可见贴壁细胞个数(Cells/200×)和原代细胞生长至第一次传代所需时间(first passage day,FPD);EC-T组中,对比传统组织块贴壁法(explant culture with tissue blocks,T)与胰酶消化辅助法(explant culture with trypsin digested-tissue,TD-T)和直接利用酶消化法中组织块内注射胶原酶Ⅱ提取细胞后的剩余组织块(explant culture with enzyme injected-tissue,EI-T)三种方法,记录初次见到细胞由组织块爬出时间(visibility of cells migration,VCM)、FPD、初次分瓶时已爬出细胞的组织块所占比例(Positive blocks(%)),选择效率最高的原代细胞培养方法;以CCK-8测定体外培养的细胞在平滑肌细胞培养基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12(10%-F12)培养基中的增殖的情况,并采用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、realtime RT-PCR、免疫荧光(immunofluore-scence,IF)、incellwestern方法检测平滑肌组织和所获得细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、平滑肌22α(smooth muscle 22α,SM22α)、波形蛋白(vimentin)、肌间线蛋白(desmin)、分化抗原簇90(cluster of differentiation 90,CD90)和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达情况,以对细胞进行鉴定。结果:ED和EC-T两种方法均可获得原代细胞。ED组以Cells/200×比较无统计学差异(P=0.864),但以FPD进行比较,可见以低浓度(0.5mg/ml)胶原酶Ⅱ注射入组织块内并低温(4℃)、长时间(14~24h)消化所得细胞的时间最短(中位时间8.00d,P0.05);EC-T组中,以EI-T法获得的原代细胞在VCM(中位时间6.00d,P0.05)、FPD(中位时间15.50d,P0.05)、Positive blocks(%)(中位比例86.00%,P0.05)方面均优于其他两种方法;ED组和EC-T组总FDP比较显示ED组明显短于EC-T组(P=0.000)。所培养原代细胞以梭型和长梭形为主,大小不均,可自行沿一定方向生长,表现为峰谷样图案;在SMCM中增殖良好,但在10%-F12中增殖效果不佳。这些细胞在SMCM中可传代至第6~8代,但在10%-F12中仅可传至第3~4代;细胞会随着传代次数增加体积逐渐增大并丧失梭形结构。原代培养的细胞同相应平滑肌组织一样,均可检测到α-SMA、SM22α、Vimentin、Desmin、CD90和PCNA的mRNA和蛋白,但不同体外培养条件下其平滑肌标志物表达水平不同,以10%-F12培养的细胞平滑肌标志物表达水平均高于SMCM组。结论:以平滑肌标志物鉴定ED法和EC-T法所获得的细胞为平滑肌细胞,提取食管胃结合部平滑肌细胞进行体外培养是可行的;ED法获得的细胞培养周期短;以SMCM培养平滑肌细胞可有效扩大细胞种群,但以10%-F12培养的细胞具有更好的平滑肌细胞表型。第二部分乙酰胆碱对体外培养人食管胃结合部平滑肌细胞内钙离子浓度的影响目的:使用乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)对体外培养的人食管胃结合部(esophagogastric junction,EGJ)平滑肌细胞内钙荧光变化的影响,明确各种平滑肌细胞内钙荧光变化特点,确定最佳体外人源性EGJ平滑肌细胞培养方式。方法:选取2016年11月至2017年10月因中高位食管癌行食管大部切除术患者共9例,以酶消化法和组织块法获取套索纤维、钩状纤维、食管环行肌、食管纵行肌、胃小弯侧环行肌和胃大弯侧环行肌6种人EGJ原代平滑肌细胞并分别以平滑肌培养基(smooth muscle cell medium,SMCM)和含10%新生牛血清的DMEM/F-12培养基(10%-F12)进行培养。以5μmol/L Fluo-3/am溶液负载体外培养的SMCM第3代和10%-F12第2代EGJ平滑肌细胞,在共聚焦显微镜下观察10~-66 mM Ach对有钙缓冲液和无钙缓冲液中平滑肌细胞内钙荧光的影响,记录荧光活动的起始值、峰值和结束值并记录相应时间长度,对比同种组织来源细胞钙荧光在有钙缓冲液和无钙缓冲液以及钙活动前后的差异。结果:不同培养基培养的EGJ平滑肌细胞存在不同的基础钙荧光。各组细胞加入Ach约2 s后即可见细胞内钙荧光变化。食管纵行肌细胞、胃大弯侧环形肌细胞和胃小弯侧环形肌细胞钙荧光活动相对于套索纤维细胞、钩状纤维细胞和食管环行肌细胞温和。在含钙缓冲液中,各种细胞的基础钙荧光强于无钙缓冲液,且钙活动总时间长,但荧光峰值不高。在无钙缓冲液中,酶消化法获得的细胞钙荧光更多见典型的细胞内存储钙离子释放,且仍可见较长时间钙活动。钩状纤维、套锁纤维、食管环行肌和胃小弯侧环形肌以细胞内存储钙离子释放为主要特点,而食管纵行肌、胃大湾环形肌以细胞外钙离子内流为主要特点;以酶消化法获取并以10%-F12培养的钩状纤维细胞、套索纤维细胞、食管环行肌细胞和食管纵行肌细胞在有钙缓冲液和无钙缓冲液中的钙离子活动峰值荧光差均有统计学差异。组织块法获取的细胞中,仅胃大弯侧环行肌和以10%-F12培养的套索纤维细胞峰值荧光差存在统计学差异,且各组细胞钙活动特点不如酶消化法组细胞典型。结论:在Ach诱发体外培养的EGJ平滑肌细胞内钙荧光变化过程中,钩状纤维、套锁纤维、食管环行肌、食管纵行肌、胃大弯侧环形肌和胃小弯侧环形肌均不单纯依赖于某种钙离子活动,而是将细胞内存储钙离子释放与细胞外钙离子内流相结合以有效维持较长时间的钙活动。以酶消化法获取细胞并以10%-F12进行培养是最佳体外人EGJ平滑肌细胞培养方式。第三部分钙离子相关蛋白及一氧化氮合酶在贲门失弛缓症患者腹段食管环行肌中表达的初步研究目的:明确参与细胞内Ca~(2+)变化的相关钙离子蛋白和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)在贲门失弛缓症(achalasia of the cardia,AC)患者腹段食管段环行肌的表达。方法:收集河北医科大学第四医院胸外科AC患者共10例为实验组,选取因中高位食管癌行食管大部切除术患者共17例为对照组。手术中收集两组贲门水平以上2~5cm以内腹段食管环行肌组织。以L-型钙离子通道(L-type calcium channel,LTCC)、三磷酸肌醇受体(inositol 1,4,5-triphosphate recptors,IP_3Rs)、雷诺定受体(ryanodine receptors,RyRs)三种大分子蛋白和NOS为研究对象,分别采用realtime RT-PCR和免疫组织化学(SP法)技术检测LTCC、RyRs、IP_3Rs和NOS各亚型在实验组与对照组表达的差异,同时以RT-PCR扩增各cDNA并进行碱基测序以明确判断相应mRNA是否表达。检验实验组各受体mRNA相对表达量与食管综合松驰压(integrated relaxation pressure,IRP)是否存在线性关系。结果:通过对实验组和对照组腹段食管环行肌(esophageal circular smooth muscle of control,EC)组织cDNA扩增显示,各蛋白亚型mRNA中i NOS、n NOS、Cav1.2、Cav1.3、RyR2、IP_3R1、IP_3R2和IP_3R3在两组中均为阳性表达,但eNOS、Cav1.1、RyR1、RyR3不表达;经统计分析,iNOS、n NOS、Cav1.3、IP_3R1和IP_3R2的mRNA在AC表达均增高;iNOS和Cav1.3相对mRNA表达量与IRP之间存在正相关关系。通过免疫组织化学技术检测,在实验组和对照组平滑肌组织中n NOS、Cav1.2、Cav1.3、IP_3R1、IP_3R2、IP_3R3和RyR2 7种蛋白均表达,其中n NOS局限分布于AC平滑肌组织中的神经纤维并呈强阳性染色,但平滑肌细胞质染色较对照组明显浅淡。经统计分析仅IP_3R2在AC表达升高且与mRNA表达情况一致,两组中其余蛋白表达无统计学差异。结论:在贲门失弛缓症患者腹段食管环行肌病理变化中,NOSs依然参与食管平滑肌病理状态的调节,但iNOS mRNA异常增高且n NOS在平滑肌细胞的表达明显减少;钙离子相关蛋白表达异常的肌源性因素也许在贲门失弛缓症病理生理机制中扮演着重要角色。结论:1.以平滑肌标志物鉴定酶消化法和组织块法所获得的食管胃结合部平滑肌组织来源的细胞为平滑肌细胞,提取食管胃结合部平滑肌细胞进行体外培养是可行的。在酶消化法中,以低浓度(0.5mg/ml)胶原酶Ⅱ注射于组织块并在低温(4℃)、长时间(14~24h)条件下消化的方法获取平滑肌细胞效率最佳且细胞培养周期短;以此残余组织块直接用于组织块培养法,其获取平滑肌细胞的效率最佳。体外培养的平滑肌细胞以合成型为主,形态学表现多为梭型和长梭形;在不同培养条件下其平滑肌特异性标志物的表达水平不同;以专业培养基培养平滑肌细胞可有效扩大细胞种群,但以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培养基培养的平滑肌细胞拥有更好的平滑肌细胞表型。2.在Ach诱发体外培养的食管胃结合部平滑肌细胞内钙荧光变化过程中,体外培养的钩状纤维、套锁纤维、食管环行肌和胃小弯侧环形肌细胞以细胞内存储钙离子释放为主要特点;食管纵行肌、胃大弯侧环形肌细胞以细胞外钙离子内流为主要特点。但以上细胞均不单纯依赖于某种钙离子活动,而是将细胞内存储钙离子释放与细胞外钙离子内流相结合以有效维持较长时间的钙活动,尤以酶消化法获取并以含10%新生牛血清的DMEM/F-12培养基进行培养的平滑肌细胞在乙酰胆碱介导的细胞内钙离子浓度变化中表现最佳,可作为最佳人EGJ平滑肌细胞体外培养方式。3.在贲门失弛缓症患者腹段食管环行肌病理变化中,一氧化氮合酶依然参与食管平滑肌病理状态的调节,但诱生型一氧化氮合酶mRNA异常增高且神经元型一氧化氮合酶在平滑肌细胞的表达明显减少。钙离子相关蛋白表达异常的肌源性因素也许在贲门失弛缓症病理生理机制中扮演着重要角色,其与一氧化氮合酶的相应变化在贲门失弛缓症病理生理过程中的作用应受到关注。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R571
【图文】：

图 1 食管胃结合部（黏膜侧）Fig. 1 Mucosa side of esophagogastric junction图 2 酶消化法获得的食管胃结合部原代细胞

酶消化法获得的食管胃结合部原代细胞Fig.2Primarycellsofesophagogastricjunction(EGJ)obtainedby

细胞生长

图 3 不同酶消化法获得原代细胞的比较Fig. 3 Comparison of different ED methods to obtain primary cellsThere was no statistical difference in Cells/200× (P=0.864), but it wasstatistical different to compare 0.5-EI-4 with 0.5-C-4 (P=0.006) and 0.25-T-37(P=0.004) in the first passage day (FPD) respectively. (*P＜0.05)图 4 未经酶消化辅助（T 组）组织块中细胞生长示图（×100，以 EC 为例）Fig. 4 Primary esophageal circular muscle (EC) cells obtained by traditional

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