基于3D打印技术构建类肝组织及体内外活性分析

发布时间：2020-07-30 14:00

【摘要】：第一部分:简易胶原酶消化法提取兔原代肝细胞及培养目的:探讨简易、经济的Ⅳ型胶原酶消化法提取分离新生兔原代肝细胞及体外培养。方法:采用0.1%Ⅳ型胶原酶对新生兔肝脏组织小块进行消化以提取兔原代肝细胞,体外进行单层培养,并对提取的兔肝细胞的细胞数量、细胞活力和细胞增殖能力进行检测。结果:提取的肝细胞主要呈类圆形,排列整齐,细胞透亮有光泽,立体感好,细胞界限清晰。1g肝组织可分离1.12X106个肝细胞,成活率为77%。细胞增殖能力呈先升后降趋势,细胞生长曲线较符合原代细胞生长的一般规律。结论:该实验方法简单、易操作,无需特殊设备,适合一般实验室开展原代肝细胞的提取、分离与培养。第二部分:3D生物打印技术在构建兔原代肝细胞水凝胶结构体片段上的研究目的:通过三维(3D)生物打印兔原代肝细胞—海藻酸钠—明胶共混物,探究3D生物打印技术构建类肝水凝胶结构体片段的可行性。方法:采用Ⅳ型胶原酶消化法提取分离新生兔原代肝细胞;制备海藻酸钠—明胶水溶胶,与兔原代肝细胞共混;采用圆柱状微丝逐层交错堆积技术,进行兔肝细胞—海藻酸钠—明胶共混物的3D生物打印,获得三维结构体。用钙黄绿素—AM和碘化丙啶(PI)溶液对该结构体进行活/死细胞双荧光染色,评价打印后及培养后兔肝细胞的活性,计算细胞存活率。结果:通过按照设计的参数,打印出含有兔原代肝细胞的网格状水凝胶结构体。该结构体的规格为10 mm×10 mm×1.2 mm,微丝间的孔隙相互通连,孔隙大小约450μ m×450μ m。打印后的兔肝细胞在三维结构体中仍可增殖,活/死细胞荧光染色结果表明结构体中兔肝细胞的存活率为82%±3%,兔原代肝细胞在结构体中分布均匀。结论:本研究实现了兔肝细胞共混物结构体的3D生物打印,为构建类肝组织工程结构体片段提供新思路。第三部分:四氯化碳皮下注射诱导兔肝纤维化模型目的:采用四氯化碳(CCl4)皮下注射诱导兔肝纤维化模型。方法:36只新西兰白兔随机分组:实验组30只、对照组6只。实验组开始2周颈背部皮下注射50%CC14橄榄油0.3 mL/kg,随后10周注射0.2 mL/kg,每周各2次;对照组注射等量橄榄油。实验组及对照组分别于第4、8、12周末,检测兔肝脏功能生化指标的变化,以及肝脏大体和组织病理学变化,观察肝纤维化的发展程度。结果:造模期间实验组家兔死亡6只,动物死亡率20%,对照组家兔无死亡。实验组兔肝脏纤维化程度随造模时间延长而逐渐加重,血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和γ-谷氨酰转移酶均明显升高,肝组织出现假小叶结构,造模成功率为80%。对照组肝脏功能以及组织学结构正常。结论:长期持续给予CC14可导致家兔的肝纤维化形成,成模率较高,并有较明显的阶段性变化,可进一步用于相关实验研究。第四部分:3D生物打印的肝结构体植入肝纤维化兔的研究目的:通过将三维(3D)生物打印的类肝水凝胶结构体,经肝表面贴覆法植入肝纤维化兔模型,探讨改善肝纤维化,以及形成类肝组织结构的可行性。方法:采用兔离体肝脏胶原酶消化法提取兔原代肝细胞,并采用四氯化碳(CCl4)皮下注射诱导兔肝纤维化模型。3D生物打印兔肝细胞-海藻酸钠-明胶3D水凝胶网格状结构体片段,经肝表面贴覆法植入肝纤维化兔。植入16天后,检测兔肝功能生化指标及肝脏组织病理学变化,观察肝纤维化的发展程度,以及类肝组织结构形成情况观察。结果:兔肝细胞水凝胶支架体内植入16天后,可见每个植入物大部分质量尚未降解,未降解的植入物与肝脏贴合紧密,融合生长。通过检测兔肝功能生化指标及植入物之下的肝脏组织病理学观察,表明兔肝细胞-3D水凝胶支架植入使兔肝脏纤维化程度及其肝功能生化指标有所改善,但各组之间比较均P0.05,无统计学意义。组织学观察结果表明,实验组植入物中肝细胞均匀分布,未见细胞变性及死亡,可形成类肝组织结构。结论:3D生物打印的肝结构体具有再造肝样组织片段和实现部分肝功能的潜力,将于基础医学和临床之间搭建桥梁,为肝脏再生打下基础。
【学位授予单位】：浙江省医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575
【图文】：

体积增大，部分细胞呈多边形，细胞三五成群连接生长（图２）。５ｄ后，长逡逑出许多新生细胞，逐渐成铺路石状成片生长（图３）；邋８ｄ后，细胞开始有老化现象，并逡逑有死细胞出现（图４）；邋ｌＴｌ５ｄ，细胞出现黑色颗粒状物质和空泡，逐渐死亡脱落（图５，逡逑图６）。逡逑■邋■逡逑图１初分离的新生兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图２培养３天的兔原代肝细胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑图３培养５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逦图４培养８天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑图５培养１１天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图Ｇ培养１５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

细胞清晰（图１）。接种４邋ｈ后细胞开始贴壁。培养３ｄ后，细胞拉平伸展，形逡逑状不规则，体积增大，部分细胞呈多边形，细胞三五成群连接生长（图２）。５ｄ后，长逡逑出许多新生细胞，逐渐成铺路石状成片生长（图３）；邋８ｄ后，细胞开始有老化现象，并逡逑有死细胞出现（图４）；邋ｌＴｌ５ｄ，细胞出现黑色颗粒状物质和空泡，逐渐死亡脱落（图５，逡逑图６）。逡逑■邋■逡逑图１初分离的新生兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图２培养３天的兔原代肝细胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑图３培养５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逦图４培养８天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑图５培养１１天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图Ｇ培养１５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

体积增大，部分细胞呈多边形，细胞三五成群连接生长（图２）。５ｄ后，长逡逑出许多新生细胞，逐渐成铺路石状成片生长（图３）；邋８ｄ后，细胞开始有老化现象，并逡逑有死细胞出现（图４）；邋ｌＴｌ５ｄ，细胞出现黑色颗粒状物质和空泡，逐渐死亡脱落（图５，逡逑图６）。逡逑■邋■逡逑图１初分离的新生兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图２培养３天的兔原代肝细胞（Ｘ邋４００）逡逑■邋■逡逑图３培养５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逦图４培养８天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑桯暴＿．．＿媝逡逑图５培养１１天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）邋图Ｇ培养１５天的兔原代肝细胞（Ｘ４００）逡逑１３逡逑

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