胞质内DNA识别蛋白在HBV复制中的作用

发布时间：2020-08-04 07:30

【摘要】：目的 1、观察乙型肝炎病毒（HBV）对肝癌细胞系HepG2产生天然免疫应答的影响。 2、了解细胞质内的DNA识别受体（AIM2、HMGB1、DAI）对肝癌细胞系HepG2中HBV复制的影响及其可能机制。 方法 1、用HBV1.3复制型质粒pHY106+wta转染肝癌细胞系HepG2，分别在既定时间点提取细胞总RNA，RealtimeRT-PCR检测天然免疫信号分子表达情况。 2、用不同浓度AIM2siRNA、HMGB1siRNA、DAIsiRNA与HBV1.3复制型质粒pHY106+wta共同转染肝癌细胞系HepG2，southernblot检测细胞内HBV复制中间体；realtimeRT-PCR检测DAI、HMGB1、AIM2表达情况；ELISA检测细胞上清中HBsAg与HBeAg的表达情况；并分析对HBV复制所诱导的天然免疫产生的IFIT1、IL-6、MxA表达的影响。 3、联合阻断两个DNAsensors对HBV复制及蛋白表达的影响。southernblot检测细胞内HBV复制中间体，ELISA检测细胞上清中HBsAg与HBeAg的表达情况。 4、MTT法检测siRNA与HBV1.3复制型质粒pHY106+wta共转后对细胞生长的影响。 结果 1、HBV1.3复制型质粒pHY106+wta转染HepG2后可以启动短暂的天然免疫应答，可以激活DAI、AIM2一过性升高。 2、下调DAI、HMGB1的表达后HBV的复制均受到抑制，同时HBsAg和HBeAg的分泌也受到明显抑制。而AIM2表达下调后HBV复制明显增强，同时HBsAg和HBeAg的分泌也增多。 3、随着siRNA浓度的升高，AIM2对HBV蛋白分泌的促进作用逐渐降低。而HMGB1、DAI识别蛋白则随着siRNA浓度的升高，对HBsAg和HBeAg抑制效果越明显。 4、DAI与TBK1同时下调后，HBV蛋白表达受到抑制，表明DAI的抑制作用起主要作用。DAI与AIM2同时下调后，也表现出对HBV蛋白表达的抑制。HMGB1与TBK1同时下调或HMGB1与AIM2同时下调，都表现出对HBV蛋白表达的抑制作用。 5、不论下调AIM2、DAI后，对HBV诱导的IFIT1、IL-6、MxA表达没有影响。但是下调HMGB1后，对HBV诱导的IL-6有影响，对IFIT1没有显著影响，表明HMGB1参与了HBV诱导的NF-kB-IL-6信号途径，没有参与I型IFN信号途径。 6、AIM2、DAI对HepG2细胞活力没有明显影响，而HMGB1影响HepG2活力，对细胞生长有影响。 结论 1、HBV能够诱导HepG2细胞产生天然免疫应答。 2、DAI和HMGB1可能通过某未知的信号通路参与了HBV复制和蛋白表达过程的调控，与I型干扰素通路无关。 3、AIM2也参与了HBV复制和蛋白表达的调节，其对HBV复制影响机制需要进一步研究. 本研究的创新点及意义： 对近几年新发现的胞浆内DNA识别分子DAI、HMGB1、AIM2对HBV复制的影响进行了初步研究，首次发现下调AIM2可以促进HBV复制，下调DAI、HMGB1可以抑制HBV复制，这为进一步研究胞质内DNA识别受体对HBV的影响提供了实验基础和依据，并可能为HBV治疗提供新的治疗靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R512.62
【图文】：

图1 Re a l -t i me RT - P C R 检测 HB V1 . 3复制 型质 粒 pH Y1 0 6+ wt a诱导 He pG 2细胞 产 生 天然 免 疫 下游 基 因 表达 的 时 间依 赖 性 1. 2 中间 的 接头 分 子 MY D 8 8、 S TI N G、 TR AF 6 表 达变 化 很小 ，另 外 AS C 未检 测到 结果 见 图 2。 图2 Re a l -t i m e RT - PC R 检测 HB V1 . 3复制 型质 粒 pH Y1 0 6+ wt a诱导 He pG 2细胞 产 生 天然 免 疫

RT - P C R 检测 HB V1 . 3复制 型质 粒 pH Y1 0 6+ wt a诱导 He p生天 然免 疫 信号 通 路 中 TL R s 表达 的 时 间依 赖 性 内 核酸 识 别 分 子 ：A I M 2 、 DA I 、 RI G- 1 均 有 一 过 高， 反 而有 下 降 的趋 势 ，结 果 见图 4

. Re al -t i m e RT - PC R 检测 s i RN A 下调 AI M2 后三 个 基因 表 达情 况 与 HB V 共转 后 AI M 2 下 调效 果 M 2 si R N A（ 终浓 度 20 n M ）与 HB V 1. 3 复制 型质 G 2， 质粒 转 染 24 h 后， si R N A 转染 48 h 后收 细 2 si R N A 的下 调情 况 。 可 见 AI M 2 si R N A1 干扰 共转 后 AI M 2 反而 上 调。 结 果 见图 6。

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本文编号：2780239