鼠李糖乳杆菌分泌可溶性蛋白p40预防性保护伽马干扰素诱导损伤enteroids肠上皮功能及紧密连接

发布时间：2020-08-06 12:09

【摘要】：研究目的肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是最常被诊断的消化道疾病。对于大多数患者而言,肠易激综合征病程迁延,反复发作,病情随时间的变化而变化。在IBS发生之前进行的手术、其他疾病的发生以及同时并发的焦虑以及抑郁等心理障碍都将导致该疾病的预后变差,同时患病人群的生活质量及工作效率显著降低。在过去的40多年间,多种致病因素被发现参与了肠易激综合征的发生发展。过去的传统研究认为脑-肠轴调节异常、胃肠道动力异常、内脏感觉异常以及精神心理异常等是IBS的主要病因,但这些传统研究理论只能解释部分IBS患者的发病机制。随着近年研究深入发现肠粘膜通透性增加、肠道微生态系统的改变、肠道免疫激活等是部分IBS患者发病的主要病理机制。临床证据显示,在腹泻型肠易激整合征(IBS-D)患者中观测到了小肠以及结肠渗透性增高。肠道屏障是维持肠上皮完整并保护机体免受外界环境干扰破坏的主要防御机制。对于个体而言肠道屏障的作用主要体现在:吸收肠内营养物质以及抵御外界危险致病物质渗透进入粘膜下组织。破坏肠道上皮屏障功能在慢性炎症性肠道疾病的发生发展中起到重要作用。肠粘膜通透性的改变将导致肠道细菌负荷量增加,诱导肠粘膜固有层食物抗原刺激肠粘膜引起炎症。正常肠道中寄居大量非致病细菌,组成肠道生物屏障,其中大部分益生菌参与维持正常肠道屏障功能,这部分益生菌的作用机制被广泛深入研究。益生菌是一类活性微生物,当摄取足够量时可改善宿主(如动物或人类)肠道内微生态的平衡,并对宿主有正面效益。益生元是一类营养物质,通常指碳水化合物,可以促进益生菌的生长。临床研究通过可靠数据评估益生菌对IBS的作用,在最近的一项荟萃分析中包括35个随机临床试验发现,益生菌作为一类改善IBS症状的制剂,可以缓解腹痛,腹胀,胀气等典型IBS症状(相对危险度,0.79;95%CI,0.70-0.89)。随着研究深入,益生菌发挥益生作用的多个机制被探索发觉,包括竞争性黏附上皮细胞、改善肠道微生态、增强宿主免疫系统、保护肠上皮屏障等。在众多益生菌中,乳酸杆菌和双歧杆菌作为其中的优势菌群,被大量研究并广泛使用,相关的食物副产品为越来越多人所接受。临床相关研究指出,从健康人体分离得到的乳酸杆菌已被证实可以改善模型动物的肠道屏障功能并缓解IBS患者不适症状。部分基础研究发现,提高参与紧密连接信号的基因表达是维护并加强肠道屏障功能完整性的潜在机制,例如,乳酸杆菌参与调节T84细胞系上皮细胞间E-cadherin以及?-catenin在内的黏附连接蛋白的基因表达。此外,使用乳酸杆菌孵育肠上皮细胞会差异性影响黏附连接蛋白的磷酸化,丰富蛋白激酶C亚型含量,从而积极调节上皮屏障功能。在许多肠道疾病中,我们发现促炎因子水平的改变和肠道通透性之间存在密切关联,提示促炎因子通过损伤上皮细胞间连接增加细胞间通透性从而破坏肠上皮功能。在后续研究中使用益生菌作用于肠道,能有效预防细胞因子诱导的上皮损伤,促进肠粘膜屏障的加固。鼠李糖乳杆菌GG是乳酸杆菌的一种,近年来被深入研究,结果发现鼠李糖乳杆菌GG抑制细胞因子诱导的肠上皮细胞凋亡。针对鼠李糖乳杆菌GG随后深入研究发现该细菌能产生两种特异性分泌蛋白,p40和p75,将两者分别作用于上皮细胞发现可再现鼠李糖乳杆菌GG抑制细胞因子诱导的上皮细胞凋亡,防止过氧化物诱导损伤上皮屏障。p40和p75分别通过激活PI3K/Akt信号通路和PKC-MAPK信号通路参与上皮细胞抗凋亡作用,阐明鼠李糖乳杆菌GG两种分泌蛋白的肠道益生作用不仅能够了解其作用机制,更为我们进一步开发出能规避使用活体细菌治疗所带来的问题的有效药物的战略奠定基础。随着科学发展,我们发现使用动物(主要是啮齿动物)建模人类疾病和人类疾病的病理生理之间存在差异,这样的差异导致无法准确反映相关病理生理机制,并且是临床试验中药物失效的关键因素之一。人类干细胞技术领域的快速进步使得人类组织体外培养技术日趋完善,使其成为替代动物模型应用于科研及临床相关领域的重要手段,大大减少动物模型带来的局限性。最近科学家识别并从人体小肠上成功分离出肠上皮干细胞(Lgr5+),该肠上皮功能结构称为“enteroid”,该结构缺乏肌成纤维细胞,由四种正常肠上皮细胞组成,经体外培养后最终形成隐窝-绒毛分化轴结构。该模型的成功建立将成为学习并探索全消化道干细胞功能、细胞增殖以及肠上皮细胞生理病理机制的有效平台,同时也为本次研究成功搭建体外人体三维肠道模型奠定技术基础。研究方法在此次研究中,我们通过使用三维人体enteroid模型平台,发现鼠李糖乳杆菌分泌上清能有效抑制伽马干扰素诱导的肠上皮屏障损伤,该有效抑制作用不依赖于益生菌的免疫调节作用。然而,存在于分泌上清中的有效成分仍然无从得知。为了进一步探索鼠李糖乳杆菌分泌上清中的有效成分,我们将包含多种成分的上清液跑胶蓝染后,将目标锁定在表达量最大的蛋白条带,该条带分子量为41.5KDa。通过基因重组技术合成该蛋白,首先运用PCR技术扩增p40分泌蛋白基因编码序列并将扩增后的产物结合到pET28b~+质粒表达载体。6×组氨酸被编码入P40的N端。序列分析表明1236bp开放阅读框架区间的存在。随后,利用大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pLysS大量表达该蛋白,并通过镍nitrilotrialetic酸琼脂和快速蛋白液相色谱法纯化蛋白。被纯化后的蛋白p40用于制备特异性抗体用于后续实验中。我们通过Western blot检测证实p40蛋白在鼠李糖乳杆菌分泌上清中大量表达。在此基础上,我们将p40单独加入enteroid系统中检测p40是否能够发挥有效作用抑制伽马干扰素诱导肠上皮功能损伤。在将p40蛋白预处理enteroid 12小时后,伽马干扰素(200ng/ml)随后加入该系统共同孵育24小时。研究结果结果发现伽马干扰素导致enteroid中紧密连接蛋白occludin和ZO-1基因表达量下调,使用LGG上清液以及p40预处理后则能抑制紧密连接蛋白基因下调趋势。同时,我们通过免疫耗竭技术除去LGG分泌上清中的p40后预处理enteroid,结果显示缺乏p40蛋白的LGG分泌上清无法缓解伽马干扰素诱导的上皮功能损伤。通过免疫荧光技术显示enteroid中紧密连接蛋白含量及蛋白分布,结果与上述基因改变一致。此外,我们运用显微注射法来测量enteroid上皮功能学变化,通过将荧光显色剂FD4注入enteroid球体内,监测FD4由内向外渗透性变化,结果显示伽马干扰素加快FD4从enteroid球体内向外的渗透性,而提前加入p40预处理组的渗透速率显著下降,与正常对照组保持一致,缺乏p40的LGG分泌上清组渗透性较未去除组增高。提示鼠李糖乳杆菌分泌上清中的有效成分p40预处理后能有效保护紧密连接蛋白不受促炎因子损伤,抑制伽马干扰素诱导人体enteroid肠上皮屏障破坏,维护正常的肠道功能。结论1.p40可溶性分泌蛋白的成功生产与纯化。2.p40蛋白特异性抗体的成功制备。3.LGG分泌上清预防性维护伽马干扰素诱导人体enteroid紧密连接基因及蛋白含量表达量,抑制紧密连接蛋白重分布,抑制伽马干扰素诱导人体enteroid上皮细胞渗透性增高。4.P40预防性保护伽马干扰素诱导enteroid紧密连接蛋白occludin和ZO-1基因及蛋白含量,抑制紧密连接蛋白重分布,抑制伽马干扰素诱导enteroid肠上皮屏障功能损伤。5.免疫耗竭p40后,缺乏p40的LGG分泌上清无法维护抑制伽马干扰素诱导enteroid肠上皮屏障功能损伤。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R574.4
【图文】：

正态分布,小鼠,情况,出牙

在复苏第一代时使用)。9、放回 37°C 5%CO2 孵箱进行无菌培养。（六）统计学处理使用 PAWS 18.0 统计软件进行分析，所有实验数据都以均数±标准差表示。进行正态分布和方差齐性检验，若符合，采用单因素方差分析；若不符合，则采非参数秩和检验。P<0.05 被认为有统计学差异。三、结果（一）小鼠enteroids生存情况三维体外培养小鼠 enteroids 生存状态：将小鼠小肠隐窝在肠粘膜分离出来镜下观发现，分离之后 6 小时开始出现闭合，第 3 天开始出牙，7 天之后 enteroids 大量牙，形成肠球样结构，图 16 小时第 3 天第 7 天

鼠李糖乳杆菌分泌可溶性蛋白p40预防性保护伽马干扰素诱导损伤enteroids肠上皮功能及紧密连接

四、讨论

荧光变化,变化趋势,菌群,定植

海军军医大学博士学位论文- 36 -图3 注射后0小时及10小时各组enteroid内FD4荧光变化量及FD4变化趋势图四、讨论人体内微生物数量庞大、种类繁多，基于不同的定植部位，微生物种类及作用各不相同。其中，定植于肠道的微生物是人体内最大、最复杂的微生态系统，据估计，定植于人体胃肠道内菌群将超过500种，菌群的基因总数可能是人类基因组数量1000倍，这些覆盖在全消化道的菌群跨越腔道和粘膜层3个层面[62,63]。多种不同的肠道细

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