福建省丙型肝炎流行特征及体外细胞培养模型的构建与应用

发布时间：2020-08-07 10:57

【摘要】：目的 近年疾病监测网络直报数据显示,我国丙型肝炎报告病例数呈递增态势,而丙型肝炎感染后症状的隐匿性使其易发展成慢性肝炎、肝硬化甚至是肝细胞癌,丙型肝炎已经成为重大的公共卫生问题。我国关于丙型肝炎流行病学、病原学方面的研究较少,而福建省仅在1992年进行过自然人群丙型肝炎抗体阳性率的调查,此后未见大规模的流行病学研究,也未见报道福建省丙型肝炎病毒基因型的分布特征。另外,不同基因型间对抗病毒药物的敏感性不同,而丙型肝炎病毒体外培养模型的缺乏使其在致病机制、疫苗研究、药物筛选等方面的研究长期停滞不前。因此,为了更好地预防和控制丙型肝炎,非常有必要对福建省丙型肝炎的流行特征进行分析,获取丙型肝炎流行现状的基础资料,建立丙型肝炎报告数的预测模型,为丙型肝炎防治策略的制定提供数据支持;此外,建立福建省丙型肝炎流行基因型病毒株的体外培养模型,为丙型肝炎基础研究提供平台,在此基础上进行药物筛查等工作,从实践意义上指导丙型肝炎临床用药。 方法 1、采用多阶段抽样的方法,通过横断面调查研究,获取丙型肝炎流行现状的基础资料;应用间接ELISA方法检测血清中的丙型肝炎病毒抗体,分析2006年福建省自然人群抗-HCV阳性率; 2、通过收集无偿献血者、吸毒者以及医院来源的抗-HCV阳性的血清标本,采用RT-PCR方法,分别进行C/E1区和NS5B区基因的扩增、克隆和测序,应用生物学软件对序列进行分析比较,构建序列的系统发育树,分析福建省不同人群间基因分布的特征; 3、根据《中国疾病预防控制信息系统》疫情数据库中福建省2004～2010年HCV的月报发病数据,分析其数据特征,建立最优的发病预测模型; 4、应用长片段核酸扩增和基因克隆技术,获取不同亚型HCV基因组的全长序列,构建重组质粒;将福建流行株全长基因与JFH1株的非编码区进行嵌合,经体外转录、Huh7细胞转染,构建不同亚型嵌合的体外细胞培养模型,经IFA、RT-PCR等方法对其进行验证鉴定,并初步将该模型用于体外药物筛选。 结果 1、福建省自然人群抗-HCV阳性率为0.7%,地区分布无差异,男女无差异,随着年龄增长,抗-HCV阳性率有增加趋势,尤其是50岁以上年龄组,抗-HCV阳性率远高于50岁以下年龄组;虽然1992年人群抗-HCV阳性率的调查存在假阳性率等问题,结合其他资料,可以认为人群抗-HCV阳性率呈下降趋势,但HCV防治形势不容乐观; 2、福建省丙型肝炎主要流行基因型为6a和1b,其次为3b和2a,不同人群间流行基因型有差别,临床病例的主要流行基因型为1b,而无偿献血者和吸毒者主要流行基因型为6a,从不同人群间流行基因型分布的差异可以推论,可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况;还发现可能存在混合感染的情况,主要表现为3b亚型与其他型别的重组; 3、《中国疾病预防控制信息系统》疾病监测数据显示,自2004年实行网络直报后,丙型肝炎报告数呈逐年上升趋势,且报告数的上升是由临床诊断病例数上升引起的,实验室确诊病例数基本保持稳定,临床诊断病例数的上升可能有几个方面原因:责任人报告意识增强、感染者发展为病人、报告人掌握的HCV诊断标准不严谨; 4、建立的ARIMA(2,1,0)(2,1,0)12(无常数)模型对丙型肝炎月报数进行了较好的跟踪与预测,但由于外界其他因素变化的影响,用于中短期预测效果优于长期预测。 5、扩增并拼接了6株不同亚型的丙型肝炎病毒全长基因(其中1b亚型两株,3a、3b、6a及6n亚型各一株)以及1a亚型半长片段;构建了全长重组质粒pBS1、pBR2、pBSR5、pXX4、pXX19及pXQ124; 6、成功构建了pBS1/JFH1(6a/2a)嵌合体外细胞培养模型。pBS1/JFH1经体外转录产生的感染性RNA转染Huh7细胞后产生的衍生病毒可以引起新的Huh7细胞的感染,与pJFH1相比,构建的嵌合株感染力相对较弱; 7、将构建的pBS1/JFH1(6a/2a)嵌合体外细胞培养模型初步应用于药物筛选。研究结果表明INFα能有效抑制病毒复制,而且这种抑制呈剂量依赖性,RBV、NTZ和CsA单独应用也都能抑制HCV病毒的复制,但需要较大剂量,而这三种药物与INFα联合应用,都能显著提高INFα的抗病毒作用。 结论 1、福建省自然人群抗-HCV阳性率呈现下降趋势,但由于受HCV易慢性化特点的影响,使多年前HCV较高的阳性率表现为目前发病率的逐年增加。 2、完成福建省不同人群HCV基因流行型分析,发现可能存在主要流行基因型由1b向6a转变的情况以及目前存在较多HCV混合感染的情况。 3、扩增并拼接了6株5个亚型的HCV全长基因,成功构建出pBS1/JFH1(6a/2a)嵌合体外细胞培养模型。该模型用于药物筛选具有可行性,可为深入研究HCV的毒力基因、致病机制等基础性研究提供有利的工具。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R512.63
【图文】：

意义（经 Fisher’s 精确概率法检验 P=0.036）。结果见表 1-2 及图 1-1。表 1-2 福建省自然人群抗-HCV 阳性率年龄别、性别分布表男 女 合计检测数 阳性数 阳性率(%) 检测数 阳性数 阳性率(%) 检测数 阳性数 阳性 177 0 0.00 160 0 0.00 337 0 0. 142 0 0.00 134 2 1.49 276 2 0. 184 2 1.09 280 0 0.00 464 2 0. 174 0 0.00 240 3 1.25 414 3 0. 163 1 0.61 221 2 0.90 384 3 0.9 127 2 1.57 149 3 2.01 276 5 1. 967 5 0.52 1184 10 0.84 2151 15 0. 0.44 0.88 0.

30～40 岁1992 年 33 740 773 4.272006 年 3 411 414 0.7211.517 0.001合计 36 1151 1187 -40～50 岁1992 年 27 536 563 4.802006 年 3 381 384 0.7811.994 0.001合计 30 917 947 -50 岁～1992 年 11 279 290 3.792006 年 5 271 276 1.812.021 0.155合计 16 550 566 -合计1992 年 152 3657 3809 3.9954.741 <0.002006 年 15 2136 2151 0.70合计 167 5793 5960 -

3b 型分支形成一个大簇，各株间基因进化距离比较接近。6a 型分支中形成了五簇，仅一簇与香港株及英国株进化距离较为接近，其余各簇基因间亲缘关系较远。2a 型分支形成一簇，与日本株及印尼株在进化关系上均较为接近。不同人群间应用 C/E1 分型法得到的分型结果，其核苷酸序列同源性及变异频率的结果见表 2-5 及图 2-7。可以看到各人群不同亚型间核苷酸序列的同源性皆在 88％以上，符合亚型的判断标准。表 2-5 不同人群 C/E1 分型法各亚型间核苷酸序列同源性1a 1b 2a 3a 3b 6a 6n临床病例 92.01% 89.8% 93.23% - - 93.61% -吸毒者 96.20% 91.39% 93.88% 92.30% 92.88% 90.67% 97.26%无偿献血者 95.83% 90.11% 93.92% - 96.46% 92.00% 100.00%

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本文编号：2783891