肝素对高糖诱导的水通道蛋白在人腹膜间皮细胞上表达的影响

发布时间：2020-08-07 12:40

【摘要】： 目的:水通道蛋白(aquaporin,AQP)是Agre等人于1988年分离红细胞Rh血型抗原的一段32KD多肽的过程中无意得到的一段28KD的多肽,后来被证实为介导细胞内外水转运的通道,在微生物、植物、哺乳动物中广泛存在,并在多种器官的生理和病理中发挥重要作用。本研究旨在通过肝素对葡萄糖诱导体外培养的人腹膜间皮细胞(human perotoneal nesothelial cells,HPMCs)对AQP1、AQP3mRNA及蛋白表达的影响。方法:从连续不卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis, CAPD)治疗的慢性肾脏病患者腹膜透析流出液中分离并培养人腹膜间皮细胞,第二代细胞应用免疫组化方法进行细胞鉴定,第三代细胞用于实验,分别按照不同的实验要求分成2.5%葡萄糖组、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素组、2.5%葡萄糖加5×10-3mg/ml肝素组、2.5%葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素组。采用逆转录多聚酶链式反应(Reverse transcription polymerase chain reaction , RT-PCR)半定量分HPMCs中AQP1、AQP3mRNA的表达水平,采用免疫细胞化学法检测HPMCs上AQP1、AQP3的蛋白表达水平。结果: 一、葡萄糖及肝素诱导腹膜间皮细胞AQP1、AQP3mRNA的影响 1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分别处理HPMC不同时间后检测,结果显示葡萄糖可显著诱导间皮细胞表达AQP1mRNA上调,并随时间延长而增多,与无糖组比较具有显著的统计学差异,且AQP1mRNA表达量在24小时最大(t=-53.576,P0.01)。而葡萄糖组与葡萄糖加肝素组比较无显著统计学差异(P0.05)。 2、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分别处理HPMC不同时间后检测,结果显示葡萄糖可显著诱导间皮细胞表达AQP3mRNA上调,并随时间延长而增多,与无糖组比较具有显著的统计学差异,且AQP3mRNA表达量在24小时最大(t=-43.743,P0.01)。而葡萄糖组与葡萄糖加肝素组比较无显著统计学差异(P0.05)。 3、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加不同浓度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分别处理HPMC 4小时后,检测细胞表达AQP1mRNA的变化。结果显示葡萄糖及葡萄糖加肝素组AQP1mRNA表达均高于无糖组,有显著统计学差异(P0.05),但葡萄糖组与葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素组比较无显著统计学差异(P0.05),而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素组比葡萄糖组AQP1mRNA的表达量明显增加(t=-37.676,P0.05)。 4、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加不同浓度的肝素(2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml、1.5×10-2mg/ml)分别处理HPMC 4小时后,检测细胞表达AQP3mRNA的变化。结果显示葡萄糖及葡萄糖加肝素组AQP3mRNA表达均高于无糖组,有显著统计学差异(P0.05),但葡萄糖组与葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素组比较无显著统计学差异(P0.05),而葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素组比葡萄糖组AQP3mRNA的表达量明显增加(t=-30.578,P0.05)。二、葡萄糖及肝素诱导腹膜间皮细胞AQP1、AQP3的影响免疫细胞化学结果显示无糖组见棕黄色颗粒主要分布在胞浆和胞膜上;与无糖组比较,葡萄糖和葡萄糖加肝素组阳性表达明显增加,胞核上亦可见棕黄色深染颗粒,有明显统计学差异(P0.01);AQP1蛋白表达在葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素组与葡萄糖组及葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素组比较,统计学分析有明显差异(t=4.405,6.066, 4.983, P0.01); AQP3蛋白表达在葡萄糖加1.5×10~(-2)mg/ml肝素组与葡萄糖组及2.5×10~(-3)mg/ml、5×10~(-3)mg/ml肝素组比较,统计学分析亦有明显差异(t=3.412,5.484,3.667,P0.01);而葡萄糖组与葡萄糖加2.5×10-3mg/ml、5×10-3mg/ml肝素组比较无明显统计学差异(P0.05)。葡萄糖组及葡萄糖加1.5×10-2mg/ml肝素组细胞免疫组化图片可见胞核及胞浆有空泡样变,而葡萄糖加常规剂量肝素组无明显空泡样变。结论: 1、葡萄糖和大剂量肝素均可显著诱导人腹膜间皮细胞上水通道蛋白mRNA和蛋白的表达上调。常规剂量肝素对人腹膜间皮细胞上水通道蛋白mRNA和蛋白的表达无明显影响。 2、从免疫细胞化学图片可以看出葡萄糖组和大剂量肝素加葡萄糖组体外培养的人腹膜间皮细胞胞浆及胞核有明显空泡样变化,常规剂量肝素加葡萄糖组的间皮细胞空泡样表现不明显。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2008
【分类号】：R572.2
【图文】：

葡萄糖,CD45抗原,白细胞,第Ⅷ因子相关抗原

倒置相差显微镜下显示，最初细胞呈多形性，星状，多角形占多数，约10天左右细胞可达融合，融合后细胞似鹅卵石样外观，典型的为铺路石样(图1、2)。2、免疫组化鉴定免疫组化结果显示，培养的人腹膜间皮细胞角蛋白及波形蛋白抗原表达均阳性，胞浆中可见棕色颗粒，胞核中未见(图3、4)。第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原表达阴性，胞浆及胞核中未见棕色颗粒(图5、6)。据此可排除成纤维细胞、内皮细胞和白细胞。图1 低倍镜观察（10×10）图2 高倍镜观察（10×40）图3 细胞角蛋白阳性结果图4 细胞波形蛋白阳性结果图5 第Ⅷ因子相关抗原阴性图6 白细胞CD45抗原阴性二、葡萄糖及肝素诱导腹膜间皮细胞AQP1、AQP3mRNA的影响1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分别处理HPMC 0、2、4、8、24小时后，检测细胞表达AQP1mRNA的变化。结果显示葡萄糖可显著诱导间皮细胞表达AQP1mRNA上调，并随时间延长而增多，呈正相关关系(P<0.05)，与无糖组比较具有显著的统计学差异，且AQP1 mRNA表达量

葡萄糖,CD45抗原,白细胞,阴性

抗原、白细胞CD45抗原表达阴性，胞浆及胞核中未见棕色颗粒(图5、6)。据此可排除成纤维细胞、内皮细胞和白细胞。图1 低倍镜观察（10×10）图2 高倍镜观察（10×40）图3 细胞角蛋白阳性结果图4 细胞波形蛋白阳性结果图5 第Ⅷ因子相关抗原阴性图6 白细胞CD45抗原阴性二、葡萄糖及肝素诱导腹膜间皮细胞AQP1、AQP3mRNA的影响1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分别处理HPMC 0、2、4、8、24小时后，检测细胞表达AQP1mRNA的变化。结果显示葡萄糖可显著诱导间皮细胞表达AQP1mRNA上调，并随时间延长而增多，呈正相关关系(P<0.05)，与无糖组比较具有显著的统计学差异，且AQP1 mRNA表达量

细胞角蛋白,葡萄糖,CD45抗原,白细胞

2、免疫组化鉴定免疫组化结果显示，培养的人腹膜间皮细胞角蛋白及波形蛋白抗原表达均阳性，胞浆中可见棕色颗粒，胞核中未见(图3、4)。第Ⅷ因子相关抗原、白细胞CD45抗原表达阴性，胞浆及胞核中未见棕色颗粒(图5、6)。据此可排除成纤维细胞、内皮细胞和白细胞。图1 低倍镜观察（10×10）图2 高倍镜观察（10×40）图3 细胞角蛋白阳性结果图4 细胞波形蛋白阳性结果图5 第Ⅷ因子相关抗原阴性图6 白细胞CD45抗原阴性二、葡萄糖及肝素诱导腹膜间皮细胞AQP1、AQP3mRNA的影响1、用2.5%葡萄糖、2.5%葡萄糖加2.5×10-3mg/ml肝素分别处理HPMC 0、2、4、8、24小时后，检测细胞表达AQP1mRNA的变化。结果显示葡萄糖可显著诱导间皮细胞表达AQP1mRNA上调，并随时间延长而增多，呈正相关关系(P<0.05)，与无糖组比较具有显著的统计学差异，且AQP1 mRNA表达量

【共引文献】