胰高血糖素样多肽-2的重组表达及其对肠道保护作用机制的实验研究

发布时间：2020-08-08 12:43

【摘要】： 目的意义:严重烧伤后造成肠粘膜血流量下降,肠粘膜组织损伤及通透性增加,使肠道屏障功能障碍,造成肠道细菌移位,引发多器官功能障碍,是导致伤后高代谢的重要原因。因此促进严重烧伤后肠道修复,能减轻脏器炎症反应,防止肠源性感染,改善代谢障碍,加快创面愈合,是临床救治重要措施之一。肠道作为人体最大的内分泌器官,其自身分泌许多肠道激素对肠道结构功能起着重要的保护作用,随着近年来对胰高血糖素样多肽-2(Glucagons like peptide 2,GLP-2)认识的不断深入,发现其对肠道有特异性保护作用。且有广泛临床应用前景。 本研究利用基因重组技术设计构建了GLP-2原核表达载体并诱导表达,初步观察其对烧伤后大鼠肠道及肠上皮细胞的保护作用,利用体外细胞模型,探讨GLP-2促细胞增殖的作用机制及调控因素,为今后临床应用提供理论依据。 材料与方法: 1.利用pET31b(+)表达载体,对GLP-2序列进行重组设计,构建表达质粒进行原核表达,优化条件后表达并进行亲和层析纯化、脱盐。溴化氰裂解后行western blot(WB)鉴定,并低温干燥保存。 2.采用30%TBSAⅢ度烧伤大鼠模型作为体内实验模型,随机分为正常对照组(N);烧伤对照组(C);重组GLP-2治疗组(Gr)及化学合成GLP-2治疗组(G)。检测大鼠伤后第7天肠粘膜通透性,肠粘膜湿重与肠段及躯壳重比,肠粘膜蛋白及肠道病理形态学的变化。RT-PCR及WB检测GLP-2R的表达,利用脂质体基因转染构建稳定表达GLP-2R的Caco-2/GLP-2R(+)细胞作为体外研究模型,随机分为正常对照组(N);缺氧对照组(C);缺氧后重组GLP-2处理组(Gr)及缺氧后化学合成GLP-2处理组(G)。观察不同GLP-2对缺氧后细胞增殖、乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性的影响,并检测细胞CDK4及ZO1蛋白表达的变化。 3.构建caveolin-1/pEGFPN2质粒及体外合成caveolin-1 siRNA后瞬时转染Caco-2/GLP-2R(+)细胞,将细胞分为正常对照组(AN)、缺氧对照组(AC)、缺氧后GLP-2处理组(AG)、caveolin-1上调细胞缺氧后GLP-2处理组(CG)、caveolin-1下调细胞缺氧后GLP-2处理组(EG),检测细胞cAMP浓度,GRK2(ser280)磷酸化蛋白变化及细胞增殖,同时应用信号通路抑制剂观察GLP-2信号转导,WB检测ERK信号转导通路中相关蛋白及Akt(ser473)蛋白磷酸化表达的变化,免疫共沉淀检测caveolin-1与GLP-2R的作用,。观察GLP—2对缺氧后细胞增殖信号转导途径的影响以及caveolin-1对GLP-2R跨膜信号的调控 结果: 1.成功设计构建GLP-2/pET31b(+)质粒质粒,测序正确;在BLR(DE3)感受态大肠杆菌种诱导表达最佳条件为1mMIPTG诱导表达4h,通过亲和层析纯化及溴化氰裂解法获得单体GLP-2约100mg,重组得率5mg/100ml。 2.给予重组GLP-2及合成GLP-2后,烧伤后第7天,与烧伤对照组相比,大鼠的肠粘膜通透性明显降低,肠粘膜蛋白含量、肠粘膜与肠段重及与躯壳重之比均明显升高(P＜0.05),而两种GLP-2之间差异无显著性意义(P＞0.05)。形态学观察两种GLP-2均能减轻烧伤后肠粘膜病理损伤。体外实验结果显示,细胞严重缺氧8h立即加入1000nM的GLP-2,24、72h后能够明显增加Caco-2/GLP-2R(+)细胞的细胞增殖(P＜0.05),重组GLP-2与合成GLP-2效果无明显差别(P＞0.05)。而GLP-2处理72小时后,细胞乳酸脱氢酶及蔗糖酶活性无明显变化(P＞0.05)。CDK4及ZO1蛋白表达较缺氧对照组增强。 缺氧后立即给予1000nM的GLP-2处理,24h后,缺氧对照组cAMP含量明显降低(P＜0.01),而GLP-2处理组的cAMP却维持在一个较高水平。CG组细胞的cAMP明显增加,而EG组cAMP含量下调。GLP-2处理24h后,能够明显增加缺氧细胞的增殖(P＜0.05),在CG组细胞增殖更加明显(P＜0.05),EG组增殖作用下降。GLP-2处理后30min,磷酸化GRK2蛋白表达较缺氧对照组增强,无论上调或下调caveolin-1后,磷酸化GRK-2表达下降。给予不同信号通路抑制剂后发现,MEK1/2特异性抑制剂U0126及PI3特异抑制剂LY294002能够明显抑制GLP-2的促增殖作用(P＜0.05),而P38特异性抑制剂SB203580却不能抑制GLP-2促增殖作用。。缺氧后给予GLP-2能增强ERK信号途径中c-Raf、MEK1/2、ERK1/2及核内p90RSK磷酸化蛋白的表达,也能增强PI3信号途径中Akt磷酸化蛋白的表达。caveolin-1上调后ERK信号通路中相关磷酸化蛋白的表达增强增强,caveolin-1下调后相关磷酸化蛋白的表达减弱。 结论: 1.构建GLP-2原核表达载体。诱导表达纯化,为GLP-2获得提供了一种新的方法。 2.重组GLP-2及化学合成GLP-2能够降低严重烧伤后大鼠肠粘膜通透性,增加粘膜重量及蛋白含量,减轻肠粘膜的损伤程度。对Caco2/GLP-2R(+)细胞具有明显的促增殖作用,但对细胞无明显毒性,对蔗糖酶活性没有明显的影响,能够增强缺氧后细胞CDK4及ZO1蛋白表达,可能参与了细胞分裂及细胞间紧密连接的调控机制。 3.GLP-2对细胞的促增殖作用伴有cAMP的增加,而磷酸化GRK2蛋白负反馈机制可能参与了对cAMP的调控。GLP-2对细胞增殖的作用依赖于ERK及PI3途径,其可以引起c-Raf,MEK1/2,ERK1/2及P90RSK磷酸化蛋白表达增强,也使Akt磷酸化蛋白表达增强。而可能不依赖于P38信号途径。Caveolin-1对GLP-2R信号转导可能有调控作用,本实验中,其可促进GLP-2介导的细胞增殖及激活ERK,PI3信号途径。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R644;R574
【图文】：

0.050图2一1.*-一﨑一*，一.一正常组烧伤组重组GLP一2组合成GLP一2组注:与烧伤组相比，**.P<0刀1。GLP一2对烧伤后大鼠肠粘膜通透性的影响 (FITc一 Dmg/l们，x士s) 1.2GLP一2对烧伤后大鼠粘膜湿重/肠段，湿重/躯壳重以及粘膜蛋白含量的影响:烧伤后7d，烧伤组大鼠肠粘膜与肠段重及与躯壳重之比较正常组均明显下降(P<0.05)，肠粘膜蛋白含量也明显减低(P<0.05)。说明烧伤后肠粘膜功能受到损伤，而给予GLP一2后7d

图2一4.GLP一2对烧伤后大鼠肠粘膜蛋白含量的影!l向(mg/g湿重，x士s)1.3GLP一2对烧伤后大鼠肠道病理损伤的影响:正常大鼠空肠粘膜绒毛完整，致密且排列整齐(图2一5)，烧伤后大鼠伤后第7天，肠粘膜绒毛明显变短，脱落，排列紊乱，间质水肿，散在较多炎细胞浸润，基底层变薄(图2一6)。而GLP一2组伤后7d损伤比烧伤组有所减轻，粘膜下轻度水肿，绒毛排列较为规则，长短较为一致，未见明显的上皮脱落，基底层完整。重组GLP一2与合成GLP一2无明显区别(图2一7，2一8)

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本文编号：2785578