靶向瘦素基因的siRNA对肝星状细胞生物学活性影响的实验研究

发布时间：2020-08-10 13:33

【摘要】： 第一部分 瘦素在肝纤维化组织中的表达研究 目的:探讨瘦素在肝纤维化发生、发展中的表达及临床意义。 方法:应用免疫组织化学方法检测了30例肝组织,其中10例正常肝组织和20例肝纤维花组织,了解肝组织中瘦素的表达情况。 结果:与正常肝组织相比,瘦素在肝纤维化组织中的表达显著增加(P0.01)。肝纤维化组织中胆小管上皮细胞和肝细胞呈瘦素免疫反应阳性。 结论:瘦素的异常表达与肝纤维化的发生、发展有关,提示瘦素参与了肝纤维化的病理过程。 第二部分 靶向瘦素基因的siRNAs真核表达质粒筛选平台的建立 目的:构建具有特异性瘦素(leptin)基因siRNA功能的表达载体,筛选有效的靶向瘦素基因的siRNA真核表达质粒。 方法:以leptin为目的基因,以产生siRNA质粒载体psiRNA-hH1neo为表达模板,细胞内转录合成7对特异的siRNAs,即siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454、siRNA146、siRNA237、ssiRNA108,其中ssiRNA108为对照siRNA。构建能在真核细胞中表达的靶向瘦素基因的siRNAs重组质粒,用酶切方法和测序法对重组体进行鉴定。应用脂质体介导重组质粒转染HSC,用MTT检测细胞体外黏附能力。 结果:①酶切和序列测定表明,成功构建了靶向leptin的siRNAs表达载体;②与未转染组相比,转染外源重组质粒的细胞,体外黏附能力受到显著抑制,黏附抑制率在32.52%～87.82%间,在转染psiRNA97、psiRNA108、psiRNAl46、psiRNA237、psiRNA278、psiRNA454、pssiRNA108后,细胞黏附率分别是32.52%、35.07%、69.80%、66.45%、55.45%、49.76%、87.82%。其中siRNA278、siRNA108、siRNA97、siRNA454的抑制效果较强。 结论:本研究构建的leptin siRNAs表达载体中siRNA278、siRNA108、siRNA97和siRNA454有较强的抑制HSC的黏附力。 第三部分 靶向瘦素基因的siRNAs对肝星状细胞生物学活性的影响 目的:研究靶向leptin基因的siRNAs在大鼠肝星状细胞中leptin表达情况及对HSC生物学特性的影响。 方法:把siRNAs真核表达载体转入HSC细胞内,筛选稳定细胞克隆,应用RT-PCR、Western blot、免疫细胞化学和流式细胞仪等方法,分析靶向leptin基因的siRNAs在HSC的表达及HSC细胞的增殖和、活化和胶原的沉积来评价siRNAs对活化型肝星状细胞生物学活性的影响。 结果:靶向leptin基因的siRNAs在转染的细胞内可以下调基因的表达,抑制HSC的增殖、细胞的活化和胶原的沉积。 结论:靶向leptin基因的siRNAs通过抑制靶基因及下游基因的表达逆转活化型HSC的生物学特征,因此为肝纤维化的基因治疗提供一种新的方法。 第四部分 靶向leptin的siRNAs对瘦素信号转导机制等的影响 目的:检测靶向leptin的siRNAs对信号转导蛋白p-STAT3和细胞因子TGFβ1的影响,初步探讨siRNAs对leptin的信号传导机制等的影响。 方法:采用脂质体2000转染siRNAs重组质粒,HSC细胞经过300μg/ml G418筛选4周后收集细胞,采用RT-PCR和Western Blot和免疫组化方法检测转染细胞的TGFβ1和信号转导相关蛋白p-STAT3的表达。 结果:与未转染组相比,转染siRNAs后,HSC中p-STAT3、TGFβ1表达下降。 结论:p-STAT3、TGFβ1参与了leptin在肝纤维化中的信号转导;siRNAs抑制信号转导对于肝纤维化的治疗有一定的前景。 第五部分 siRNA联合α-干扰素抗肝纤维化的实验研究 目的:实验研究表明siRNA对肝星状细胞有抑制作用。本实验拟进一步研究α-干扰素(alpha-interferon,α-IFN)与靶向leptin的siRNA97单独及联合作用对肝星状细胞体外活性的影响。 方法:构建靶向leptin的siRNA97,用α-IFN和siRNA97处理HSC,通过绘制细胞生长曲线、软琼脂集落形成实验、流式细胞术(FCM)来研究其对细胞的增殖抑制作用,ELISA法测定细胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量,PCR-ELISA试剂盒测定细胞的端粒酶活性。 结果:与对照组相比,α-IFN和siRNA97均能明显抑制HSC增殖(P0.05),α-IFN和siRNA97联合应用时抑制作用较二者单独作用时强(P0.01);细胞在软琼脂中集落形成率明显下降(P0.01);可降低端粒酶活性的表达(P0.05);FCM显示细胞周期移行被阻滞于G0/G1期;细胞上清液中Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量明显降低(P0.01)。 结论:siRNA97联合α-IFN的体外抗纤维化作用比单独应用α-IFN和siRNA97效果好。 第六部分 奥曲肽对大鼠肝星状细胞胞质内游离钙及细胞增殖的影响 目的:探讨在常氧和低氧条件下奥曲肽(octreotide)对大鼠肝星状细胞(HepaticStellate Cell)胞内游离钙([Ca2+]i)及增殖的调节。 方法:采用钙荧光探针(Fura-2/AM)负载培养的大鼠HSC,观察常氧和低氧条件下培养48h后octreotide对HSC的[Ca2+]i的调节,同时用四唑盐(MTT)比色法比较不同浓度的octreotide对大鼠HSC增殖的影响。环磷酸腺苷(cAMP)和环磷酸鸟苷(cGMP)放免分析药盒测cAMP、cGMP浓度。 结果:与常氧条件相比,低氧条件下HSC[Ca2+]i显著升高(P0.01),其值分别为(137.7±7.8)和(293.2±12.4)nmol/L。500、800和1000μg/L octreotide在常氧状态下可引起HSCs的[Ca2+]i降低(P0.05),其值分别为(92.5±2.5)、(83.8±2.3)和(76.6 ±2.2)nmol/L。低氧时500、800和1000μg/L octreotide可引起HSCs的[Ca2+]i降低 (P0.01),其值分别为(204.3μ7.4)、(174.1±4.8)和(156.6±6.6)nmol/L。常氧对照 组A值(0.232±0.016)明显低于低氧对照组(0.533±0.036),(P0.01); 经500、 800和1000μg/L octreotide处理后,无论是常氧还是低氧状态下A值均明显降低 (P0.01)。低氧条件下cAMP和cGMP含量不发生改变(P0.05);无论是常氧还 是低氧状态,经过octreotide 500μg/L处理后,cAMP和cGMP含量增高(P0.05), 而octreotide 800、1000μg/L组更高(P0.01)。 结论:缺氧可通过第二信使系统促进HSC的增生,而octreotide无论常氧还是低 氧条件下剂量依赖性抑制HSCs增殖;cAMP、cGMP参与了对HSC的调节。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R575.2
【图文】：

1.HE染色结果正常肝组织由有较清晰的肝小叶，肝小叶以中央静脉为中心，四周是放射状排列的肝细胞索和肝血窦，肝血窦内可见枯否氏细胞，小叶间有门管区。见图1。

图1正常人的肝脏HExZooFig.1thenormalhumanliver图2正常肝的leptin免疫组化ABCx200Fig.2inununohistoehemiealABCmethodoflePtininnormalliver图3肝纤维化的leptin免疫组化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod图4肝纤维化的leptin免疫组化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

图3肝纤维化的leptin免疫组化ABCxZOOFig.3inununohistoehemiealABCmethod图4肝纤维化的leptin免疫组化ABCx200Fig.4iln印unohistoehemiealABCmethodofleptininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis图5肝纤维化的leptin免疫组化ABex200Fig.5immunohistoehemiealABCmethod图6肝纤维化的leptin免疫组化ABCx200Fig.6ifnmunohistoehemiealABCmethodofleotininhepatiefibrosisofleptininhepatiefibrosis

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 赵晓龙;瘦素:一种潜在的胃肠道激素[J];国外医学(内科学分册);2003年01期

2 朱波,罗成基;核转录因子-κB与细胞凋亡[J];国外医学.临床生物化学与检验学分册;2001年01期

3 张立煌,姚航平,曹雪涛,于益芝,陈洪,李敏伟;γ-干扰素基因修饰肝细胞治疗血吸虫病肝纤维化实验研究[J];中华传染病杂志;1999年03期

4 梁志清,何振平;贮脂细胞TGF-β1反义基因转移及对细胞外基质合成的抑制作用[J];中华医学杂志;1998年11期

本文编号：2788143