肝脏特异性敲除生长激素受体引发非酒精性脂肪肝病变的机制探讨

发布时间：2020-08-12 18:09

【摘要】：目的:非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD),是以弥漫性肝细胞肥大、泡性肝脂肪变性为病理特征的一类慢性肝病。顾名思义,NAFLD是指除酒精和其他明确的损伤肝脏的因素之外,所发生的肝脏病变。近年来,NAFLD患者的数量在逐年升高,已严重威胁到人类健康。《中国脂肪肝防治指南(科普版)》(2015版)中显示:截止2015年,中国成年人脂肪肝患病率约为15%(6.3%-27%)。非酒精性脂肪肝与糖尿病、肥胖等代谢综合征密切相关,现已居全球慢性肝病的首位。生长激素(Growth hormone,GH)是一类由脑垂体所分泌的、由191个氨基酸组成的单肽链,通过与生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)结合发挥作用,是调节机体生长、发育等过程的重要内分泌因子。在肝内,生长激素通过生长激素受体的介导刺激合成胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)。低水平的GH和IGF-1与NAFLD的严重程度相关。在肥胖的啮齿类动物和生长激素缺乏的病人中,给予GH和IGF-1治疗可以减轻脂肪肝的状况。这些证据表明GH在肝脏脂代谢的进程中发挥了关键作用。本文将利用肝脏特异性敲除生长激素受体(liver-specific knockout of growth hormone receptor mice,LiGHRKO mice)8周龄雄性小鼠来讨论GH/IGF-1轴与NAFLD之间的联系。期望寻找到治疗NAFLD的新药物靶点。方法:1.利用Cre-Loxp杂交技术,将同为C57BL/6J遗传背景的Alb-cre和GHR~(fl/fl)小鼠杂交,同时具有Alb-cre和GHR~(fl/fl)基因的小鼠为LiGHRKO小鼠。利用PCR扩增技术和琼脂糖凝胶电泳实验对3周龄小鼠进行基因型鉴定。繁育得到8周龄的LiGHRKO雄性小鼠作为实验组,同窝出生的GHR~(fl/fl)小鼠为对照组。2.利用PCR、qRT-PCR实验分别检测肝脏及其他组织GHR基因的DNA复制和RNA转录水平,进行组织特异性敲除验证。3.取8周龄LiGHRKO雄鼠和对照组小鼠,每组8-10只,进行体重称量,解剖取材,各器官称重,并对肝脏组织进行拍照。4.内眦取血后,全血存于1.5 ml EP管,4000 rpm,离心10min,取上清即为血清。进行血清学检测,检测血清中谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)、极低密度脂蛋白(very low-density lipoprotein,VLDL)的含量。5.取8周龄LiGHRKO雄性小鼠和对照组小鼠的肝脏组织,进行RNA提取,反转录得到cDNA,通过qRT-PCR实验进行糖脂代谢相关基因表达检测。6.取8周龄LiGHRKO雄性小鼠和对照组小鼠的肝脏组织,进行蛋白质提取,通过免疫印迹和免疫组织化学实验检测PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1通路的变化情况。7.利用线粒体活性氧、线粒体膜电位以及线粒体功能相关基因表达检测LiGHRKO小鼠和对照组小鼠的线粒体功能情况。结果:1.肝脏特异性敲除生长激素受体后,8周龄LiGHRKO雄性小鼠体重及其他脏器无明显变化,肝脏重量与体积增大,呈非酒精性脂肪肝表型。2.肝脏特异性敲除生长激素受体后,LiGHRKO雄性小鼠出现糖耐量减退、胰岛素抵抗和糖代谢异常。3.8周龄LiGHRKO雄性小鼠的脂肪合成显著增加,脂肪分解明显减少。肝脏特异性敲除生长激素受体致使肝脏内脂肪过度沉积。4.肝脏特异性敲除生长激素受体,可减少p-PI3K ~(Tyr607)、p-AKT ~(Ser273)、p-mTOR ~(Ser2448)、p-p70S6K1 ~(Ser371)的表达水平,抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信号通路的转导。5.肝脏特异性敲除生长激素受体后,线粒体活性氧升高、膜电位降低、线粒体相关基因表达减少、线粒体结构紊乱。结论:本研究结果证明,肝脏组织生长激素受体的缺失致使小鼠出现胰岛素抵抗、血清中VLDL、LDL、AST、ALT的水平升高。同时,肝脏组织生长激素受体的缺失增加了肝脏脂肪摄取和脂肪新生。LiGHRKO小鼠的PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信号通路传导受到抑制。而PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信号通路在肝脏组织中的抑制,会导致糖异生和线粒体的功能异常。我们发现,LiGHRKO小鼠的线粒体活性氧(ROS)升高、膜电位下降(ΔΨm)、线粒体结构与活力相关基因表达量减少,致使线粒体结构受损,进而导致线粒体功能紊乱。本实验推断,肝脏中GH/IGF-1轴损伤后抑制PI3K/AKT/mTOR/p70S6k1信号通路的转导,引发肝脏线粒体功能异常,进而导致肝脏脂代谢异常与NAFLD病变的发生。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R575.5
【图文】：

疾病谱

图 1 非酒精性脂肪肝的疾病谱引自 Byrne CD, Targher G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology.Apr 2015;62: S47-S64.)

代谢性疾病

图 2 NAFLD 是多系统代谢性疾病(引自 Byrne CD, Targher G. NAFLD: a multisystem disease. Journal of Hepatology.Apr 2015;62: S47-S64.)

结构图,生长激素受体,结构图,肝脏

图 3 生长激素受体的结构图 Waters MJ, BrooksAJ. JAK2 activation by growth hormone and other cBiochemical Journal. 2015; 466:1-11.)分泌到血液中，再运送到主要靶器官—肝脏，在肝脏 GHR

【参考文献】