抑制HSP90通过减轻坏死性凋亡改善小鼠原发性胆汁性胆管炎

发布时间：2020-08-14 22:26

【摘要】：目的:原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一种以肝内小胆管非化脓性炎症破坏,肝小叶汇管区炎症,慢性胆汁淤积为特点的自身免疫性肝病。研究表明坏死性凋亡在PBC的发病中扮演了重要角色,但其调控机制仍不明确。热休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)可以调节坏死性凋亡,且在多种肝病的发病中起重要作用。本研究旨在明确HSP90在PBC的发病中的表达水平变化,探究干预HSP90对PBC小鼠疾病进程的影响。进而阐明HSP90是否通过调节坏死性凋亡影响PBC的进程。方法:将6周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为以下5组:正常对照组、PBC组、PBC+2.5mg/Kg 17-DMAG治疗组、PBC+5mg/Kg 17-DMAG治疗组和PBC+10mg/Kg17-DMAG治疗组。对造模组小鼠,分别于第1天和第15天腹腔注射100μg的2OA-BSA。第三天开始,每三天腹腔注射一次Poly I:C(5 mg/kg),建立PBC动物模型。治疗组在造模的同时隔日腹腔注射一次17-DMAG进行治疗。正常对照组每次腹腔注射等体积PBS。8周后处死小鼠,将小鼠血清及肝脏标本留存。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定血清中抗PDC-E2抗体和IL-6、IFN-γ、TNF-α水平。通过RT-PCR检测肝脏促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、MCP-1的水平。蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测HSP90、RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL和p-MLKL蛋白水平。HE染色观察肝脏组织炎症程度。免疫组化(IHC)检测HSP90的表达。结果:(1)小鼠肝脏HE染色可见PBC模型组汇管区,尤其是受损的小叶间胆管周围大量炎症细胞浸润。血清中抗PDC-E2抗体滴度明显升高。证明PBC小鼠模型建立成功。(2)IHC和Western blotting结果显示HSP90在PBC小鼠的肝脏中表达较正常对照组升高。(3)抑制HSP90降低了PBC小鼠血清中抗PDC-E2抗体浓度,减少了血清和肝脏中的促炎细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α和MCP-1的表达,并减轻了肝脏组织炎症程度,明显改善了小鼠PBC的严重程度。(4)PBC小鼠肝脏中的RIP1、RIP3、p-RIP3、MLKL、p-MLKL表达升高,抑制HSP90下调了上述分子的表达。结论:我们成功构建了小鼠PBC模型,发现HSP90在PBC小鼠肝脏中的表达增高。抑制HSP90通过减轻坏死性凋亡改善了小鼠PBC病情严重程度。HSP90有希望成为PBC的重要治疗靶点。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R575.7
【图文】：

HE染色,小胆管,淋巴细胞,病理学特征

华中科技大学硕士学位论文结果功建立 PBC 动物模型鼠肝脏 HE 染色可见汇管区胆管炎PBC 的早期病理学特征是汇管区以中、小胆管为中心的浆细胞、淋巴细胞和嗜酸细胞浸润。我们对健康对照组和 PBC 组小鼠肝脏切片行 HE 染色，发现 PBC 小管区，尤其是受损的小叶间胆管周围大量淋巴细胞、单核细胞浸润，是典型的小胆管炎，符合 PBC 的早期病理学改变。而健康对照组汇管区无炎性细胞浸润及损伤，并且没有肝脏实质的病理改变（图 1）。

小鼠血清,抗体,肝细胞

对照组 PBC图 2：小鼠血清抗 PDC-E2 抗体C 小鼠的肝脏中表达增高的研究表明 HSP90 在健康对照组的肝细胞中表达较弱，且精性肝病小鼠的肝细胞中表达增加[27]。为了探究 HSP90 在通过免疫组化和 Western Blot 评估了 HSP90 蛋白在 PBC 小照组小鼠肝脏石蜡切片免疫组化结果显示正常小鼠肝细胞阳性，与之前的研究结果相一致。PBC 组肝细胞胞浆内可绿色箭头标识）。而且肝细胞细胞核可见深棕色，呈强阳性胆管上皮细胞内可见大面积棕染（黑色箭头标识）（图 3A中的表达比对照组高。同时，Western Blot 进一步验证了 IH HSP90 可能与 PBC 的发病有关。

对照组

对照组及PBC组HSP90表达情况

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